大腸桿菌超級裂菌液

產(chǎn)品簡介：

大腸桿菌是實(shí)驗(yàn)室最常用的革蘭氏陰性菌原核表達(dá)體系。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁由內(nèi)外兩層脂雙層細(xì)胞膜夾雜一層肽聚糖組成。肽聚糖的糖鏈部分由高度重復(fù)二糖單元構(gòu)成（N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸以beta-1,4糖苷鍵連接），肽聚糖的肽段部分通常是通過丙氨酸的氨基和胞壁酸的羧基形成酰胺鍵，不同肽段的側(cè)鏈之間再形成交聯(lián)。

大腸桿菌超級裂菌液，適用于大腸桿菌菌體的快速、溫和、低成本裂解，釋放菌體內(nèi)蛋白。本產(chǎn)品為單組份，操作簡單、重復(fù)性好。含有的溶菌酶可以在1分鐘內(nèi)破開細(xì)菌細(xì)胞壁，將其降解為胞壁二糖；含有的核酸酶可在1分鐘內(nèi)消化細(xì)菌的DNA和RNA，將其降解為寡聚核苷酸片段。使用本產(chǎn)品可以有效降低細(xì)菌裂解后上清粘度， 抑制目的蛋白的降解，提高后續(xù)樣品澄清效果，提升樣品上柱純化的效率，減少內(nèi)毒素污染。

裂菌液組份中含有溶菌酶，是一類水解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶類總稱，可以水解細(xì)菌肽聚糖的不同部位，例如T7噬菌體溶菌酶是一種酰胺酶（Amidase），可以打開肽聚糖的糖鏈和肽鏈之間的酰胺鍵；雞蛋清溶菌酶可以打開肽聚糖的糖鏈部分 (N-acetyl glucosaminidase)；內(nèi)肽酶可以切開肽聚糖肽鏈(Endopeptidase)。大腸桿菌超級裂菌液含有復(fù)合溶菌酶，可以在細(xì) 菌細(xì)胞壁的不同位置高效切開裂口，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的完美釋放。

菌體破裂以后，胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、小分子、DNA、RNA都會釋放到胞外，此時(shí)需要將核酸充分打斷，否則帶有強(qiáng)負(fù)電性 的核酸將和目的蛋白以及雜質(zhì)相互作用，導(dǎo)致純化的產(chǎn)物純度降低，并堵塞純化填料、降低柱效以及影響填料的使用壽命。在超聲和均質(zhì)破菌方法中，物理的剪切力無差別的打斷肽聚糖、核酸以及蛋白質(zhì)，為降低樣品粘度，通常要多次超聲或者均質(zhì)。過度的物理作用不僅會造成特定的目的蛋白斷裂，純化產(chǎn)物出現(xiàn)降解條帶，也會因?yàn)闊崃康淖饔迷斐傻鞍?質(zhì)的活力喪失。而大腸桿菌超級裂菌液含有重組超級核酸酶，它可以快速切斷DNA、RNA，不會影響目的蛋白的一級序列 以及高級結(jié)構(gòu)的完整。因此使用本裂菌液提取蛋白，不會造成目的蛋白的“額外”破壞，是一種溫和、快速、高效的破菌方案。超聲裂菌和溶菌酶裂菌的純化結(jié)果示例見下圖。

保存條件: 

本產(chǎn)品為單組分，短期內(nèi)（60天）可放置于2-8℃保存，長期保存可凍存于-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品運(yùn)輸溫度為2-8℃；可以在收到產(chǎn)品后，分裝凍存，復(fù)溶后需要混合均勻再使用。

主要用途：

1. 小量細(xì)菌的快速裂解，后續(xù)可接小量誘導(dǎo)蛋白的可溶性鑒定。

2. 中量細(xì)菌的快速裂解，后續(xù)可接蛋白純化、性質(zhì)表征。

3. 大量細(xì)菌的快速裂解，降低樣品粘度，有利于提高規(guī)模制備的效率以及蛋白純度。

產(chǎn)品使用：

1. 菌體收集

對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。通過離心、超濾等適當(dāng)方法，去除發(fā)酵液上清，收集菌體，對菌體進(jìn)行稱重，記錄重量。

2. 菌體裂解

2.1 按照1g濕菌體加入9mLTris-HCl緩沖液（如TBS緩沖液：20mMTris，150mMNaCl，pH7.6）的比例，對菌體進(jìn)行重懸，確保分散充分，可采用旋渦震蕩、磁力攪拌等手段。緩沖液不推薦磷酸鹽（PBS），因其會抑制核酸酶活性，但抑制作用并不明顯，如果使用PBS緩沖液，請適當(dāng)延長裂菌時(shí)間。

2.2 按照菌體重懸液（步驟2.1）體積的1/9（V/V，例如：使用了9mLTBS緩沖液重懸，就加1mL裂菌液）加入大腸桿菌超級裂菌液，攪拌或振蕩混合均勻。

2.3 將步驟2.2 樣品置于4-25℃條件下（溫度根據(jù)蛋白穩(wěn)定性進(jìn)行合理選擇），裂解1-10分鐘，會看到菌體懸液漸漸變清亮透明。如果目的蛋白可溶，可以選擇快速裂解，約1分鐘即可釋放80%以上的目的蛋白至上清中；如果目的蛋白是包涵體，可以選擇更長裂菌時(shí)間，盡量充分消化細(xì)胞壁，以便獲得純度更高的包涵體。

2.4 使用離心（離心力＞8000g）的方法，分離上清與沉淀。如果目的蛋白為可溶蛋白，取上清進(jìn)行后續(xù)純化；如果 目的蛋白是包涵體，收集沉淀樣品，對沉淀中的包涵體進(jìn)行洗滌、變性溶解，再使用適當(dāng)方法進(jìn)行純化。

注意事項(xiàng)：

1.      因裂菌液采用了溶菌酶消化細(xì)胞壁的策略進(jìn)行破壁，會釋放胞壁二糖成份，競爭結(jié)合麥芽糖結(jié)合蛋白的底物結(jié)合位點(diǎn)，因此本產(chǎn)品與MBP-tag純化體系不兼容。其它常見的His-tag、GST-tag、TactinII-tag、FC-tag、S-tag、proteinA-tag、 CBD-tag 等技術(shù)體系不受影響。

2.      本產(chǎn)品使用了溫和的非離子型去垢劑，不會造成蛋白失活，使用的復(fù)合溶菌酶以及超級核酸酶均不帶純化標(biāo)簽，不會干擾下游純化。

3.      實(shí)驗(yàn)室最常用的誘導(dǎo)劑為IPTG，通常使用終濃度為10μM-1mM，誘導(dǎo)劑濃度對于目的蛋白的溶解性影響并不大， 不用在摸索誘導(dǎo)劑濃度上浪費(fèi)時(shí)間，我們推薦使用0.1mM IPTG的誘導(dǎo)濃度。若希望改善可溶比例，優(yōu)先考慮低溫以 及增加促溶標(biāo)簽。乳糖也可以很好的誘導(dǎo)特定啟動子的表達(dá)，最終收獲的菌量會比IPTG更高。在LB培養(yǎng)基中，37℃ 誘導(dǎo)，通常4小時(shí)目的蛋白表達(dá)量即達(dá)到高峰，可以收集菌體。如果使用低溫誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間可適當(dāng)延長至6-8小時(shí)。 過夜誘導(dǎo)對于大部分蛋白的表達(dá)并沒有明顯的收益，菌量增加很少但降解條帶增多。

4.      實(shí)驗(yàn)室的LB培養(yǎng)基表達(dá)，每升可以收獲菌體約為3g，如果是發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，每升培養(yǎng)基可以收獲菌體100g。 收獲的菌體暫時(shí)不用，需要保存在-20℃或-80℃條件，防止降解。

5.      對于使用LB培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，可以按照每升收獲的菌體加入27mLTBS 緩沖液，低溫震蕩或者超聲清洗槽內(nèi) 超聲分散完全后加入3mL大腸桿菌超級裂菌液，震蕩混勻即可看到菌體懸濁液逐漸澄清。

6.      菌體裂解在最優(yōu)條件下1分鐘即可以完成，如果緩沖液不合適，比如含有磷酸鹽、含有高鹽、pH偏離中性等，裂解速度會變慢。如果趕進(jìn)度，可以去離心，對可溶目的蛋白的釋放影響不大，離心之后，核酸酶與溶菌酶留在上清中， 可以繼續(xù)消化。如果不趕進(jìn)度，可以適當(dāng)延長裂菌時(shí)間。

7.      室溫20-25 ℃條件下，裂菌液含有的酶活力較高，但通常推薦4℃低溫裂菌，以控制目的蛋白的降解。

8.      離心之后，通常樣品已經(jīng)得到充分澄清，并不需要再做深層過濾或者膜包過濾；如果樣品不夠澄清，可以考慮增加 其它澄清步驟。

9.      大腸桿菌超級裂菌液把核酸酶與溶菌酶整合到了一個(gè)溶液中，屬于All inone 的形態(tài)， 使用更加簡潔，無需再添加額外的超級核酸酶。但加入裂菌液之前，菌體要分散充分，這樣更有利于裂菌。

10.  為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。