Magneti-G His 標簽免疫沉淀/免疫共沉淀試劑盒

產品介紹

1 Magneti-G商標

Magneti-G商標來自于磁性（Magnetic）的英文諧音，G為高聚物的漢語拼音的首字母，因此本公司帶有這一商標的產品，均為高聚物材質的磁性微球。這一商標主要用于一系列基于抗體親和方法的標簽蛋白 IP試劑盒，目前已有Anti-His-tag、Anti-Myc-tag、Anti-HA-tag、Anti-DYKDDDDK-tag、Anti-GFP-tag和Anti-RFP-tag六種標簽 IP試劑盒。

2 His標簽

His標簽肽段一般是 6個或者 8個組氨酸，它可以連接在融合蛋白的 N端或者 C端，由于分子量較小，并且較容易分離和純化，His-tag融合標簽與其他標簽相比有很多明顯優勢，是目前用于純化的融合標簽中使用最為廣泛的一種。His標簽多肽可以特異性的結合鎳離子，帶有組氨酸標簽的重組蛋白可以被鎳柱吸附，從而達到純化的目的。

3 Anti-His抗體

Anti-His抗體可以用于檢測和 His標簽融合表達蛋白的表達、細胞內定位，也可以用于 His融合表達蛋白的純化、定性或定量檢測。本公司的Anti-His親和力非常高，適合做 WB、IP等蛋白互作實驗。

4 磁珠性質

高聚物磁珠采用高分子聚合技術將超順磁性材料和高分子材料完美地結合在一起，具有更快的磁響應性同時保持微球良好的分散性、極低的非特異性吸附和更豐富的結合位點。磁珠具體性能見表 1。

表 1：Magneti-G Anti-His Beads產品性能

5 試劑盒組分

本產品適用于原核和真核細胞裂解物或者培養上清中分泌表達的 His標簽蛋白的 IP、Co-IP等蛋白質相互作用實驗，具體組分見表 2。

 表 2：試劑盒組份

使用方法

1 緩沖液配制

1) 1×Lysis Buffer(A+B)配置：使用前將 IP Lysis Buffer A（5×）用 ddH?O稀釋成 1×IP Lysis Buffer A，并補加終濃度為 0.1%的 IP Lysis Buffer B（1ml 1×IP Lysis Buffer A中加 1μl IP Lysis Buffer B），標記為 1×Lysis Buffer（A+B）備用。稀釋后的緩沖液建議 4℃保存；

2) 1×IP Wash Buffer配置：將 IP Wash Buffer（10×）用 ddH?O稀釋10倍使用。如：配置10ml 1×IP Wash Buffer，具體操作為取 1ml IP Wash Buffer，加入9ml ddH?O，充分混勻標記為 1×IP Wash Buffer即可使用。實驗未用完的 1×IP Wash Buffer可穩定保存在 2-8℃ 3個月，保存時間過久易長菌。

3) PBS為自備試劑。

2 樣品前處理

*懸浮細胞樣品裂解

1) 1000×g室溫離心 5min，棄上清，收集細胞；

2) 用適量 PBS將細胞團輕輕重懸，將細胞懸液以 1000×g離心 5min ，棄上清，收集細胞。重復三次；

3) 向細胞團塊中加入預冷 1×Lysis Buffer(A+B)，每 1×10? -5×10? cells使用1000μl。

4) 將上述加了 1×Lysis Buffer（A+B）的樣品上下顛倒混勻 5-10次，隨后置于冰上裂解 5-10min，期間混勻 2-3次。

5) 13,000 ×g離心10 min，去除細胞碎片。

6) 將上清轉移至新的離心管中，標記為細胞裂解樣品。

*貼壁細胞樣品裂解

1) 小心除去單層細胞的培養基

2) 用適量預冷的 PBS細胞清洗三次。

3) 根據表 3中推薦體積將 1×IP Lysis Buffer（A+B）慢慢滴加至細胞孔板中，滴加時盡量覆蓋整個平皿，隨后置于冰上裂解 5-10min，期間混勻 2-3次。

4) 將上述裂解好的樣品轉移至新的離心管中，約 13,000 ×g離心 10 min，去除細胞碎片。

5) 將上清轉移至新的離心管中，標記為細胞裂解樣品。

表 3. 1×IP Lysis Buffer（A+B）推薦體積

*注意事項

真核表達的分泌蛋白可直接取培養上清離心。真核表達的胞內蛋白先用 1×PBS（pH=7.4）清洗 3-5次，隨后用裂解液裂解細胞后離心取上清，再進行后續步驟。

核酸是強電性物質，如果核酸吸附到磁珠上，最終將造成雜蛋白變多。除去核酸有兩個常用的方法：

1) 充分超聲可以打斷核酸，但過度超聲也會造成蛋白降解。

2) 使用伯儀生物超級核酸酶(SLP008)消化，這一方法需要注意緩沖液的選擇。

低濃度非離子型表面活性劑，如吐溫-20、曲拉通-100可以幫助分散脂類團塊，有助于獲得更純的目的蛋白。

3 磁珠漂洗

1) 將磁珠充分混勻后取 20μl磁珠置于離心管中，向管中加入 500μl 1×IP Wash Buffer，上下顛倒混勻 5-10次。

2) 將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。

3) 向管中加入 500μl 1×IP Wash Buffer，上下顛倒混勻 5-10次，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。

4) 重復操作 3次。

5) 注：本試劑盒中提供適量陰性對照（Magneti-G Control IgG Beads），免疫沉淀實驗時建議設置陰性對照組。使用方法與 Magneti-G Anti-His Beads完全一致。若有更多需求，可以訂購本公司的 Magneti-G Control IgG Beads(貨號：MP5801) 。

4 樣品孵育

1) 向上述漂洗好的磁珠中加入 500-1000μl的細胞裂解樣品，常溫或4℃下孵育 60min（建議在旋轉混勻儀上孵育，使樣品和磁珠充分接觸）。

2) 孵育結束后，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，將上清轉移至新的離心管中，留樣備檢。

3) 向離心管中加入 500μl 1×IP Wash Buffer，輕輕顛倒混勻 5-10次后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后棄去上清。

4) 重復操作 5次。

注：孵育溫度和時間范圍推薦為：室溫0.5 h-2 h或者 4℃、1h-4h，根據實際的結合效果適當調整孵育時間，不建議過夜孵育，過夜孵育可能會引起過多的非特異性吸附。磁珠每次洗滌，加入 IP Wash Buffer后可以冰上靜置 3-5分鐘。

5 蛋白洗脫 

1) 洗脫液洗脫

每 20μl原始磁珠體積加入 40μl洗脫液，常溫或 4℃洗脫 5-10min，期間輕輕混勻 3-5次。孵育結束后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸取上清至新的離心管中，進行 Western檢測。

注：Elution Buffer D可以充分洗脫標簽蛋白，且能保證磁珠上的抗體只有很少量的脫落，但是磁珠上可能有少量目的蛋白殘留。

2) SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫

每 20μl原始磁珠體積加入 30μl的 PBS（自備）重懸磁珠，再加入 30μl的 2×SDS Loading Buffer，輕搖搖晃混勻后 95-100℃高溫處理 5-10min。將離心管置于磁力架上分離 10s，取上清進行 SDS-PAGE電泳或進行Western檢測。

注：SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫會使目的蛋白能夠完全從磁珠上脫離，但是抗體也會完全脫落。磁珠上 Anti-His抗體為鼠抗，后續 WB實驗建議選擇兔抗。Western檢測的上樣量建議控制在 20μl以內，剩余的樣本可凍存于-20℃保存。

實驗原理

作用類型:IP/Co-IP實驗

相互作用：抗原抗體間的相互作用

特征：不能顯示蛋白質之間的相互作用是直接還是間接的；體內自然狀態下的相互作用

應用方向：蛋白檢測、測定兩種目標蛋白質是否在體內結合、確定一種特定蛋白質的互作蛋白

注意事項

1) 本產品保存在 2-8℃，不可凍結保存；

2) 本產品出現輕微團聚屬正常現象，可正常使用；

3) 本產品不要使用含有 DTT等還原劑的細胞裂解液樣品，DTT可能會導致抗體配體的脫落；

4) 本產品能耐受≤2M尿素，高濃度的尿素會導致抗體配體脫落；

5) 在清洗和洗脫時避免吸取到磁珠，清洗時吸取到磁珠會影響最終的載量，洗脫時吸取到磁珠會影響目的蛋白的質量和電泳效果，第一次洗脫后可以將洗脫液置于新的離心管中，再次置于磁力架上進行吸附。

參考信息

1) His tag IP實驗：樣品為胞內表達蛋白，含有 His和 DYKDDDDK標簽。

2) 取 0.5ml懸浮細胞（≈1.5×10?個）常溫下 1×PBS（pH=7.4）清洗三次后快速進行裂解、離心；

3) 加入 20 μl已經清洗過的磁珠于離心后的上清中搖晃孵育 30min；

4) 將含有磁珠的樣品管轉移到磁力架上，分離磁珠和液體，用移液器吸走上清，留下磁珠；

5) 用 1×IP Wash buffer清洗5次后加入 2×SDS Loading Buffer 99℃高溫處理 10min后進行WB；

6) 檢測抗體為Anti DYKDDDDK-HRP mAb，陰性對照(-)為不帶 His抗體的磁珠和樣本孵育。

常見問題與解答

 1 聚合物磁珠和瓊脂糖磁珠有何區別？

1) 瓊脂糖磁珠是帶孔微球，粒徑在 30-100 μm，交聯時會有一部分配體會進入球孔內部，所以偶聯載量相對較高，適用于蛋白的快速純化；而聚合物磁珠通常粒徑為 1-3 μm以下，配體主要分布在微球表面，這種類型的磁珠能夠快速結合蛋白，空間位阻影響小，適用于蛋白互作實驗，但其載量不高；

2) 推薦使用瓊脂糖磁珠進行蛋白純化實驗，使用聚合物磁珠進行蛋白互作實驗如 IP、Co-IP和 pulldown實驗等。

 2 為何結合不到目的蛋白？

1) 可能是由于蛋白無表達造成的，建議在純化前用 WB檢測下蛋白原始表達量，如果WB無信號，目的蛋白很難捕獲；

2) 樣本中有高濃度的還原劑等干擾物質，建議選用合適的裂解液。