Magneti-G HA 標(biāo)簽免疫沉淀/免疫共沉淀試劑盒

產(chǎn)品介紹

1 Magneti-G商標(biāo)

Magneti-G商標(biāo)來(lái)自于磁性（Magnetic）的英文諧音，G為高聚物的漢語(yǔ)拼音的首字母，因此本公司帶有這一商標(biāo)的產(chǎn)品，均為高聚物材質(zhì)的磁性微球。這一商標(biāo)主要用于一系列基于抗體親和方法的標(biāo)簽蛋白 IP試劑盒，目前已有Anti-His-tag、Anti-Myc-tag、Anti-HA-tag、Anti-DYKDDDDK-tag、Anti-GFP-tag和Anti-RFP-tag六種標(biāo)簽 IP試劑盒。

2 HA標(biāo)簽

血凝素(英文 hemagglutinin)是指紅血球凝聚素，血凝素具有免疫原性，抗血凝素抗體可以中和血凝素。HA標(biāo)簽是一段來(lái)源于人流感病毒血凝素蛋白第 98 ～106位氨基酸的短序列，氨基酸序列為 YPYDVPDYA，HA標(biāo)簽的分子量為 1.1 KDa，是目前廣泛應(yīng)用的標(biāo)簽之一。通過(guò)重組 DNA技術(shù)將 HA標(biāo)簽融合到目的蛋白的 C端或 N端后，有利于對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化和檢測(cè)。

3 Anti-HA抗體

Anti-HA抗體可以用于檢測(cè)和 HA標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位，也可以用于 HA融合表達(dá)蛋白的純化、定性或定量檢測(cè)。本公司的Anti-HA親和力非常高，適合做 WB、IP等蛋白互作實(shí)驗(yàn)。

4 磁珠性質(zhì)

高聚物磁珠采用高分子聚合技術(shù)將超順磁性材料和高分子材料完美地結(jié)合在一起，具有更快的磁響應(yīng)性同時(shí)保持微球良好的分散性、極低的非特異性吸附和更豐富的結(jié)合位點(diǎn)。磁珠具體性能見(jiàn)表 1。

表 1：Magneti-G Anti-HA Beads產(chǎn)品性能

5 試劑盒組分

本產(chǎn)品適用于原核和真核細(xì)胞裂解物或者培養(yǎng)上清中分泌表達(dá)的 HA標(biāo)簽蛋白的 IP、Co-IP等蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)，具體組分見(jiàn)表 2。

表 2：試劑盒組份

使用方法

1 緩沖液配制

1) 1×Lysis Buffer(A+B)配置：使用前將 IP Lysis Buffer A（5×）用 ddH?O稀釋成 1×IP Lysis Buffer A，并補(bǔ)加終濃度為 0.1%的 IP Lysis Buffer B（1ml 1×IP Lysis Buffer A中加 1μl IP Lysis Buffer B），標(biāo)記為 1×Lysis Buffer（A+B）備用。稀釋后的緩沖液建議 4℃保存；

2) 1×IP Wash Buffer配置：將 IP Wash Buffer（10×）用 ddH?O稀釋10倍使用。如：配置10ml 1×IP Wash Buffer，具體操作為取 1ml IP Wash Buffer，加入9ml ddH?O，充分混勻標(biāo)記為 1×IP Wash Buffer即可使用。實(shí)驗(yàn)未用完的 1×IP Wash Buffer可穩(wěn)定保存在 2-8℃ 3個(gè)月，保存時(shí)間過(guò)久易長(zhǎng)菌。

3) PBS為自備試劑。

2 樣品前處理

*懸浮細(xì)胞樣品裂解

1) 1000×g室溫離心 5min，棄上清，收集細(xì)胞；

2) 用適量 PBS將細(xì)胞團(tuán)輕輕重懸，將細(xì)胞懸液以 1000×g離心 5min ，棄上清，收集細(xì)胞。重復(fù)三次；

3) 向細(xì)胞團(tuán)塊中加入預(yù)冷 1×Lysis Buffer(A+B)，每 1×10? -5×10? cells使用1000μl。

4) 將上述加了 1×Lysis Buffer（A+B）的樣品上下顛倒混勻 5-10次，隨后置于冰上裂解 5-10min，期間混勻 2-3次。

5) 13,000 ×g離心10 min，去除細(xì)胞碎片。

6) 將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，標(biāo)記為細(xì)胞裂解樣品。

*貼壁細(xì)胞樣品裂解

1) 小心除去單層細(xì)胞的培養(yǎng)基

2) 用適量預(yù)冷的 PBS細(xì)胞清洗三次。

3) 根據(jù)表 3中推薦體積將 1×IP Lysis Buffer（A+B）慢慢滴加至細(xì)胞孔板中，滴加時(shí)盡量覆蓋整個(gè)平皿，隨后置于冰上裂解 5-10min，期間混勻 2-3次。

4) 將上述裂解好的樣品轉(zhuǎn)移至新的離心管中，約 13,000 ×g離心 10 min，去除細(xì)胞碎片。

5) 將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，標(biāo)記為細(xì)胞裂解樣品。

 表 3. 1×IP Lysis Buffer（A+B）推薦體積

*注意事項(xiàng)

真核表達(dá)的分泌蛋白可直接取培養(yǎng)上清離心。真核表達(dá)的胞內(nèi)蛋白先用 1×PBS（pH=7.4）清洗 3-5次，隨后用裂解液裂解細(xì)胞后離心取上清，再進(jìn)行后續(xù)步驟。

核酸是強(qiáng)電性物質(zhì)，如果核酸吸附到磁珠上，最終將造成雜蛋白變多。除去核酸有兩個(gè)常用的方法：

1) 充分超聲可以打斷核酸，但過(guò)度超聲也會(huì)造成蛋白降解。

2) 使用伯儀生物超級(jí)核酸酶(SLP008)消化，這一方法需要注意緩沖液的選擇。

低濃度非離子型表面活性劑，如吐溫-20、曲拉通-100可以幫助分散脂類(lèi)團(tuán)塊，有助于獲得更純的目的蛋白。

3 磁珠漂洗

1) 將磁珠充分混勻后取 20μl磁珠置于離心管中，向管中加入 500μl 1×IP Wash Buffer，上下顛倒混勻 5-10次。

2) 將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。

3) 向管中加入 500μl 1×IP Wash Buffer，上下顛倒混勻 5-10次，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。

4) 重復(fù)操作 3次。

5) 注：本試劑盒中提供適量陰性對(duì)照（Magneti-G Control IgG Beads），免疫沉淀實(shí)驗(yàn)時(shí)建議設(shè)置陰性對(duì)照組。使用方法與 Magneti-G Anti-HA Beads完全一致。若有更多需求，可以訂購(gòu)本公司的 Magneti-G Control IgG Beads(貨號(hào)：MP5801) 。

4 樣品孵育

1) 向上述漂洗好的磁珠中加入 500-1000μl的細(xì)胞裂解樣品，常溫或4℃下孵育 60min（建議在旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育，使樣品和磁珠充分接觸）。

2) 孵育結(jié)束后，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，留樣備檢。

3) 向離心管中加入 500μl 1×IP Wash Buffer，輕輕顛倒混勻 5-10次后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后棄去上清。

4) 重復(fù)操作 5次。

注：孵育溫度和時(shí)間范圍推薦為：室溫0.5 h-2 h或者 4℃、1 h-4 h，根據(jù)實(shí)際的結(jié)合效果適當(dāng)調(diào)整孵育時(shí)間，不建議過(guò)夜孵育，過(guò)夜孵育可能會(huì)引起過(guò)多的非特異性吸附。磁珠每次洗滌，加入 IP Wash Buffer后可以冰上靜置 3-5分鐘。

5 蛋白洗脫

1) 洗脫液洗脫

每 20μl原始磁珠體積加入 40μl洗脫液，常溫或 4℃洗脫 5-10min，期間輕輕混勻 3-5次。孵育結(jié)束后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸取上清至新的離心管中，進(jìn)行 Western檢測(cè)。

注：Elution Buffer D可以充分洗脫標(biāo)簽蛋白，且能保證磁珠上的抗體只有很少量的脫落，但是磁珠上可能有少量目的蛋白殘留。

2) SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫

每 20μl原始磁珠體積加入 30μl的 PBS（自備）重懸磁珠，再加入 30μl的 2×SDS Loading Buffer，輕搖搖晃混勻后 95-100℃高溫處理 5-10min。將離心管置于磁力架上分離 10s，取上清進(jìn)行 SDS-PAGE電泳或進(jìn)行Western檢測(cè)。

注：SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫會(huì)使目的蛋白能夠完全從磁珠上脫離，但是抗體也會(huì)完全脫落。磁珠上 Anti-HA抗體為鼠抗，后續(xù) WB實(shí)驗(yàn)建議選擇兔抗。Western檢測(cè)的上樣量建議控制在 20μl以?xún)?nèi)，剩余的樣本可凍存于-20℃保存。

實(shí)驗(yàn)原理

作用類(lèi)型:IP/Co-IP實(shí)驗(yàn)

相互作用：抗原抗體間的相互作用

特征：不能顯示蛋白質(zhì)之間的相互作用是直接還是間接的；體內(nèi)自然狀態(tài)下的相互作用

應(yīng)用方向：蛋白檢測(cè)、測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合、確定一種特定蛋白質(zhì)的互作蛋白

注意事項(xiàng)

1) 本產(chǎn)品保存在 2-8℃，不可凍結(jié)保存；

2) 本產(chǎn)品出現(xiàn)輕微團(tuán)聚屬正常現(xiàn)象，可正常使用；

3) 本產(chǎn)品不要使用含有 DTT等還原劑的細(xì)胞裂解液樣品，DTT可能會(huì)導(dǎo)致抗體配體的脫落；

4) 本產(chǎn)品能耐受≤2M尿素，高濃度的尿素會(huì)導(dǎo)致抗體配體脫落；

5) 在清洗和洗脫時(shí)避免吸取到磁珠，清洗時(shí)吸取到磁珠會(huì)影響最終的載量，洗脫時(shí)吸取到磁珠會(huì)影響目的蛋白的質(zhì)量和電泳效果，第一次洗脫后可以將洗脫液置于新的離心管中，再次置于磁力架上進(jìn)行吸附。

參考信息

1) HA tag IP實(shí)驗(yàn)：樣品為胞內(nèi)表達(dá)蛋白，含有 His和 HA標(biāo)簽。

2) 取 0.5ml懸浮細(xì)胞（≈1.5×10?個(gè)）常溫下 1×PBS（pH=7.4）清洗三次后快速進(jìn)行裂解、離心；

3) 加入 20 μl已經(jīng)清洗過(guò)的磁珠于離心后的上清中搖晃孵育 30min；

4) 將含有磁珠的樣品管轉(zhuǎn)移到磁力架上，分離磁珠和液體，用移液器吸走上清，留下磁珠；

5) 用 1×IP Wash buffer清洗5次后加入 2×SDS Loading Buffer 99℃高溫處理 10min后進(jìn)行WB；

6) 檢測(cè)抗體為Anti His-HRP mAb，陰性對(duì)照(-)為不帶 HA抗體的磁珠和樣本孵育。

常見(jiàn)問(wèn)題與解答

 1 聚合物磁珠和瓊脂糖磁珠有何區(qū)別？

1) 瓊脂糖磁珠是帶孔微球，粒徑在 30-100 μm，交聯(lián)時(shí)會(huì)有一部分配體會(huì)進(jìn)入球孔內(nèi)部，所以偶聯(lián)載量相對(duì)較高，適用于蛋白的快速純化；而聚合物磁珠通常粒徑為 1-3 μm以下，配體主要分布在微球表面，這種類(lèi)型的磁珠能夠快速結(jié)合蛋白，空間位阻影響小，適用于蛋白互作實(shí)驗(yàn)，但其載量不高；

2) 推薦使用瓊脂糖磁珠進(jìn)行蛋白純化實(shí)驗(yàn)，使用聚合物磁珠進(jìn)行蛋白互作實(shí)驗(yàn)如 IP、Co-IP和 pulldown實(shí)驗(yàn)等。

 2 為何結(jié)合不到目的蛋白？

1) 可能是由于蛋白無(wú)表達(dá)造成的，建議在純化前用 WB檢測(cè)下蛋白原始表達(dá)量，如果WB無(wú)信號(hào)，目的蛋白很難捕獲；

2) 樣本中有高濃度的還原劑等干擾物質(zhì)，建議選用合適的裂解液。