FastCut SpeI 

產(chǎn)品簡介：

FastCut快速內(nèi)切酶是一系列經(jīng)過基因工程重組的快速限制性內(nèi)切酶，適用于質(zhì)粒 DNA、PCR 產(chǎn)物或基因組 DNA 等的快速酶切。所有 FastCut快速內(nèi)切酶在通用的 FastCut 或 FastCut Color Buffer 中都具有優(yōu)良的活性，能夠在 5~15 分鐘內(nèi)完成酶切。此外去磷酸化、連接試劑在FastCut Buffer中均具有100% 活性，支持一管化反應(yīng)，提升“酶切 - 修飾 - 連接”的體驗(yàn)。

FastCut Color Buffer包括紅色和黃色示蹤染料，可將產(chǎn)物直接用于凝膠電泳。FastCut Color Buffer 的紅色染料與2500 bp 雙鏈DNA片段在 1% 瓊脂糖凝膠中遷移速率接近；黃色染料與10 bp雙鏈DNA片段在 1% 瓊脂糖凝膠中遷移速率接近。

 識別位點(diǎn)：

ACTAGT
5'...A ↓ C T A G T...3'
3'...T G A T C ↑ A...5'

同裂酶：AhlI，BcuI

注：同裂酶對于不同的甲基化修飾也許具有不同敏感性。

產(chǎn)品組成：

保存條件: 

-20℃保存，2年有效。

建議反應(yīng)條件：

1× FastCut 緩沖液；

37℃溫育；

參照“DNA 快速酶切流程”配制反應(yīng)體系。

失活條件：

80℃溫育20 min。

功能活性檢測：

37℃下，在20 μl通用FastCut反應(yīng)體系中，1 μl FastCut SpeI能夠在15 min內(nèi)完全消化1 μg pUC19-SpeI DNA。

超長時(shí)間溫育檢測：

37℃下，在20 μl通用FastCut反應(yīng)體系中，將1 μl FastCut SpeI與1 μg pUC19-SpeI DNA共同溫育3 h，未檢測到其他核酸酶污染或星號活性引起的底物非特異性降解。更長時(shí)間酶切可能出現(xiàn)星號活性。

酶切-連接-再酶切檢測：

37℃下，使用10倍酶量的FastCut SpeI消化DNA底物，回收酶切產(chǎn)物，在22℃下使用T4 DNA Ligase (Fast)可以將超過95%的酶切產(chǎn)物重新連接。將連接產(chǎn)物再次回收后，使用相同的內(nèi)切酶可以重新切開約95%以上的連接產(chǎn)物。

非特異性內(nèi)切酶活性檢測：

37℃下，在20 μl通用FastCut反應(yīng)體系中將1 μl FastCut SpeI與 1 μg 超螺旋質(zhì)粒DNA共同溫育4 h后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，少于10%的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)變成缺刻或線性狀態(tài)。

藍(lán)白斑檢測：

使用1 μl FastCut SpeI消化含有lacZα 基因且僅在該基因上具有1個(gè)酶切位點(diǎn)的特定載體。將酶切產(chǎn)物重新連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有X-gal、IPTG和相應(yīng)抗生素的LB平板培養(yǎng)基上生長。成功連接的β-半乳糖苷酶基因可以正確表達(dá)，并生長出藍(lán)色菌落；而因酶切末端降解等原因未能重新連接的產(chǎn)物將得到白色菌落。對于FastCut系列限制酶而言，白色菌落的比例應(yīng)當(dāng)小于1%。

使用方法：

1. DNA快速酶切流程

① 在冰上按如下建議的加樣順序配制反應(yīng)體系：

a.本體系適用于經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物酶切。未純化的PCR產(chǎn)物具備一定的離子強(qiáng)度，10× FastCut Buffer 加入量可適當(dāng)減少至2 μl。但由于DNA聚合酶同時(shí)具有外切酶活性，會影響酶切產(chǎn)物，因此如下一步需進(jìn)行克隆等操作，建議酶切前對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

② 輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時(shí)離心以收集掛壁液滴；

③ 37℃溫育15 min（質(zhì)粒），或15~30 min（PCR產(chǎn)物），或30~60 min（基因組DNA）； ④ 80℃溫育20 min即可使酶失活，停止反應(yīng)（可選）；

⑤ 如果使用FastCut Color Buffer進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到的產(chǎn)物可以直接進(jìn)行上樣電泳。

2. 雙酶切或多酶切

① 每種快速內(nèi)切酶的用量為1 μl，并根據(jù)需要適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系；

② 所有快速內(nèi)切酶的體積總和不得超過總反應(yīng)體系的1/10；

③ 如果所用的幾種快速內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，應(yīng)先以最適溫度低的酶開始酶切，再添加最適溫度較高的酶，在其最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶切反應(yīng)。

3. 適用于質(zhì)粒的擴(kuò)大反應(yīng)體系

注：如果總反應(yīng)體系大于20 μl，應(yīng)適當(dāng)增加溫育時(shí)間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。

不同DNA中的酶切位點(diǎn)數(shù)量

甲基化修飾影響

在不同反應(yīng)緩沖液中的活性

注：活性數(shù)據(jù)來自限制酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下的檢測。

注意事項(xiàng)：

為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。