FastCut? Tsp45I

產品簡介：

FastCut?快速內切酶是一系列經過基因工程重組的快速限制性內切酶，適用于質粒 DNA、PCR 產物或基因組 DNA 等的快速酶切。所有 FastCut?快速內切酶在通用的 CutOne? 或 CutOne? Color Buffer 中都具有優良的活性，能夠在 5~15 分鐘內完成酶切。此外去磷酸化、連接試劑在CutOne? Buffer中均具有100% 活性，支持一管化反應，提升“酶切 - 修飾 - 連接”的體驗。

CutOne? Color Buffer包括紅色和黃色示蹤染料，可將產物直接用于凝膠電泳。CutOne? Color Buffer 的紅色染料與2500 bp 雙鏈DNA片段在 1% 瓊脂糖凝膠中遷移速率接近；黃色染料與10 bp雙鏈DNA片段在 1% 瓊脂糖凝膠中遷移速率接近。

識別位點：

GTSAC
5'...↓G T S A C ...3'
3' ... C A S T G↑...5'

同裂酶：NmuCI, TseFI

注：同裂酶對于不同的甲基化修飾也許具有不同敏感性。

產品組成：

保存條件: 

-20℃保存，2年有效。

建議反應條件：

1× CutOne? 緩沖液；

65℃溫育；

參照“DNA 快速酶切流程”配制反應體系。

本品在37℃進行酶切反應時，有50%的活性。

失活條件：

不可熱失活，請使用酚氯仿抽提或柱純化。

功能活性檢測：

65℃下，在20 μl通用CutOne?反應體系中，1 μl FastCut? Tsp45I能夠在15 min內完全消化1 μg λDNA。

超長時間溫育檢測：

65℃下，在20 μl通用CutOne?反應體系中，將1 μl FastCut? Tsp45I與1 μg λDNA共同溫育3 h，未檢測到其他核酸酶污染或星號活性引起的底物非特異性降解。更長時間酶切可能出現星號活性。

酶切-連接-再酶切檢測：

65℃下，使用10倍酶量的FastCut? Tsp45I消化DNA底物，回收酶切產物，在22℃下使用T4 DNA Ligase (Fast)可以將超過95%的酶切產物重新連接。將連接產物再次回收后，使用相同的內切酶可以重新切開約95%以上的連接產物。

使用方法：

1. DNA快速酶切流程

① 在冰上按如下建議的加樣順序配制反應體系：

a.本體系適用于經過純化的PCR產物酶切。未純化的PCR產物具備一定的離子強度，10× CutOne? Buffer 加入量可適當減少至2 μl。但由于DNA聚合酶同時具有外切酶活性，會影響酶切產物，因此如下一步需進行克隆等操作，建議酶切前對PCR產物進行純化。

② 輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時離心以收集掛壁液滴；

③ 65℃溫育15 min（質粒），或15~30 min（PCR產物），或30~60 min（基因組DNA）； ④ 酚氯仿抽提或柱純化（可選）；

⑤ 如果使用CutOne? Color Buffer進行酶切反應，得到的產物可以直接進行上樣電泳。

2. 雙酶切或多酶切

① 每種快速內切酶的用量為1 μl，并根據需要適當擴大反應體系；

② 所有快速內切酶的體積總和不得超過總反應體系的1/10；

③ 如果所用的幾種快速內切酶的最適反應溫度不同，應先以最適溫度低的酶開始酶切，再添加最適溫度較高的酶，在其最適反應溫度下進行酶切反應。

3. 適用于質粒的擴大反應體系

注：如果總反應體系大于20 μl，應適當增加溫育時間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。

不同DNA中的酶切位點數量

甲基化修飾影響

在不同反應緩沖液中的活性

注：活性數據來自限制酶標準反應體系下的檢測。

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。