Benzonase全能核酸酶

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Benzonase全能核酸酶是一種來(lái)源于粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)的非特異性核酸內(nèi)切酶，可在非常寬泛的條件下降解單鏈、雙鏈、線(xiàn)狀、環(huán)狀、天然或變性等各種形式的DNA 或RNA，產(chǎn)生長(zhǎng)度為3至5個(gè)堿基的5'-單磷酸寡核苷酸。本產(chǎn)品用途廣泛，常用于重組蛋白、病毒疫苗等生物制品中去除核酸，以及有效降低細(xì)胞、組織、微生物等蛋白裂解液樣品的粘度等。
    本產(chǎn)品為超純級(jí)，純度≥99%，無(wú)蛋白酶活性，內(nèi)毒素極低，Benzonase全能核酸酶，又稱(chēng)廣譜核酸酶，與Benzonase endonuclease、TurboNuclease等類(lèi)似酶的氨基酸序列基本一致(主要是蛋白的氨基端或羧基端所帶的標(biāo)簽或殘留氨基酸序列略有不同)，具有同樣的酶催化活性和相同的用途，大多數(shù)情況下可以相互替代。具體使用時(shí)，需要注意純度和內(nèi)毒素水平對(duì)于后續(xù)分析檢測(cè)的影響。

產(chǎn)品信息：

 保存條件: 

20oC保存，三年有效。4oC保存，至少兩個(gè)月內(nèi)有效。

適用范圍：

Benzonase全能核酸酶需1-2mM Mg²⁺作為輔助因子促進(jìn)其酶活性，最適范圍(Optimal Range, Enzyme Activity >90%)和有效范圍(Effective Range, Enzyme Activity >15%)見(jiàn)下表。

在最適反應(yīng)條件下，Benzonase全能核酸酶對(duì)于不同樣品的推薦用量和處理時(shí)間請(qǐng)參考下表。注：實(shí)際用量和處理時(shí)間 需根據(jù)樣品的實(shí)際情況進(jìn)行一定的摸索，若使用的溶液較為特殊，如為高鹽溶液，或偏酸性、偏堿性，或含有較高濃度的去垢劑、變性劑等，應(yīng)適當(dāng)增加Benzonase全能核酸酶的用量或孵育時(shí)間。

使用說(shuō)明：
1. 用于降低細(xì)胞、組織或細(xì)菌裂解液的粘度。
a. 對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：

(a) 對(duì)于貼壁細(xì)胞：吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒(méi)有干擾，可以不洗)。每1ml RIPA裂解液、Western及IP細(xì)胞裂解液或其它細(xì)胞裂解液中加入0.1-1μl Benzonase全能核酸酶，然后按照裂解液的使用說(shuō)明用于貼壁細(xì)胞的裂解。加入含有Benzonase全能核酸酶的裂解液后，冰浴或室溫孵育5-30分鐘，收集裂解液，10,000-14,000×g離心3-5分鐘，取上清，即可用于后續(xù)的 PAGE、Western和免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)。

(b) 對(duì)于懸浮細(xì)胞：250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白 沒(méi)有干擾，可以不洗)，再離心收集細(xì)胞，輕輕vortex或者彈擊管底以把細(xì)胞盡量分散開(kāi)。如果細(xì)胞量較多，必須分裝成50-100萬(wàn)細(xì)胞/管，然后再用于后續(xù)的裂解。每1ml RIPA裂解液、Western及IP細(xì)胞裂解液或其它細(xì)胞裂解液中加入0.1-1μl本Benzonase全能核酸酶，然后按照裂解液的使用說(shuō)明用于貼壁細(xì)胞的裂解。加入含有Benzonase全能核酸酶的裂解液后，冰浴或室溫孵育5-30分鐘，10,000-14,000×g離心3-5分鐘，取上清，即可用于后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)。

裂解液用量說(shuō)明：通常6孔板每孔貼壁細(xì)胞或每100萬(wàn)動(dòng)物細(xì)胞加入100微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高或者細(xì)胞比較大的情況，可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150-250微升。

b. 對(duì)于組織樣品：

(a) 把組織剪切成細(xì)小的碎片。

(b) 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入RIPA裂解液、Western及IP細(xì)胞裂解液或其它細(xì)胞裂解液，同時(shí)加入0.1-1μl本Benzonase全能核酸酶。

(c) 用玻璃勻漿器勻漿，或使用研磨儀進(jìn)行研磨，直至充分裂解。也可以把組織樣品冷凍后液氮研磨，研磨充分后加入裂解液進(jìn)行裂解。

(d) 充分裂解后，冰浴或室溫孵育5-30分鐘，10,000-14,000×g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

(e) 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過(guò)強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器或研磨設(shè)備，缺點(diǎn)是不如勻漿或研磨那樣裂解得比較充分。

c. 對(duì)于細(xì)菌或酵母樣品：

(a) 對(duì)于1ml菌液或酵母液，離心去上清，如果有必要可以使用PBS洗滌一次，充分去除液體后，輕輕vortex或者彈擊管底以把細(xì)菌或酵母盡量彈散。加入100-200微升RIPA裂解液或其它細(xì)胞裂解液，同時(shí)加入0.1-1μl Benzonase全能核酸酶。

(b) 輕輕vortex或者彈擊管底以混勻，冰浴或室溫孵育5-30分鐘，。如果希望獲得更好的裂解效果，細(xì)菌和酵母可以分別使用溶菌酶和破壁酶(Lyticase)消化，然后再使用裂解液進(jìn)行裂解。

2. 去除重組蛋白中的核酸：

重組蛋白生產(chǎn)時(shí)對(duì)核酸殘留有嚴(yán)格的要求，很多情況可以參考如下描述以去除殘留的核酸。生物樣品中DNA濃度范圍通常在0.5-5μg/ml之間，如下采用高負(fù)荷DNA濃度50μg/ml的鯡魚(yú)精子DNA溶液進(jìn)行的測(cè)試，反應(yīng)緩沖液為50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM MgCl2, 0.1 mg/ml BSA。

a.  37oC反應(yīng)22h，反應(yīng)液中Benzonase全能核酸酶終濃度為90U/ml時(shí)，可降解所有DNA；反應(yīng)液中Benzonase全能核酸酶終濃度為9U/ml時(shí)，可降95%的DNA；

b.  反應(yīng)液中Benzonase全能核酸酶終濃度為90U/ml時(shí)，23oC反應(yīng)30h可降解所有DNA；0oC反應(yīng)30h可降解99%的DNA；

c.  樣品在10mM Tris (pH8.0)緩沖液中，反應(yīng)液中Benzonase全能核酸酶終濃度為90U/ml時(shí)，23oC反應(yīng)22h可降解所有DNA；樣品在PBS緩沖液中，反應(yīng)液中Benzonase全能核酸酶終濃度為90U/ml時(shí)，23oC反應(yīng)30h可降95%的DNA。

3. 去除重組病毒中的核酸：

對(duì)于在細(xì)胞中包裝生產(chǎn)的重組病毒，在收集的細(xì)胞上清中直接加入Benzonase全能核酸酶，使之終濃度約為1U/ml，30 34oC反應(yīng)4-8h，即可有效地將宿主細(xì)胞的核酸(DNA及RNA)降解為3-5bp的核酸片段。

4. 實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定重組病毒滴度時(shí)去除核酸干擾：

在檢測(cè)重組病毒滴度時(shí)，Benzonase全能核酸酶可以去除病毒上清中基因組DNA、RNA和質(zhì)粒等核酸干擾，通過(guò)在載體的長(zhǎng)末端重復(fù)序列區(qū)(LTR)設(shè)計(jì)引物，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定重組病毒中LTR拷貝數(shù)來(lái)測(cè)定病毒顆粒數(shù)。建議在PCR管 中按照下表體系進(jìn)行設(shè)置，37oC孵育30min去除核酸后，再對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋并實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。Benzonase全能核酸酶終濃度1-5U/ml，Reaction Buffer: 10mM Tris pH8.0, 2mM MgCl2, 0.1% PEG8000, 0.1mg/ml BSA.

5. 防止細(xì)胞成團(tuán)：

Benzonase全能核酸酶加入細(xì)胞培養(yǎng)液中可以防止細(xì)胞成團(tuán)，特別是在解凍細(xì)胞時(shí)。例如全血分離的外周血單核細(xì)胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)解凍后易聚集在一起，影響后續(xù)分析和檢測(cè)。如果在PBMCs凍存液中加入終濃度為50U/ml的Benzonase全能核酸酶可以有效防止細(xì)胞成團(tuán)。Benzonase全能核酸酶不僅沒(méi)有蛋白酶的活性，而且不會(huì)對(duì)健康細(xì)胞造成傷害，因此是防止細(xì)胞成團(tuán)的理想選擇。

6. 降低大腸桿菌裂解液粘度，改善純化過(guò)程中離心難、過(guò)濾難的問(wèn)題：

大腸桿菌高密度發(fā)酵在增加菌密度的同時(shí)提高了重組蛋白的表達(dá)量，但是大腸桿菌破碎后釋放的基因組DNA會(huì)導(dǎo)致裂解液粘度大，加大了離心和澄清過(guò)濾的難度。

按照0.2g濕菌用1ml細(xì)菌裂解液重懸菌體，使用高壓破碎儀1500bar，4oC進(jìn)行均質(zhì)破碎。如果加入終濃度為25U/ml的Benzonase全能核酸酶，15oC反應(yīng)15min，與不加Benzonase全能核酸酶的細(xì)菌裂解液相比粘度降低50%；如果加入終濃度為2.5U/ml Benzonase全能核酸酶，15oC反應(yīng)30min，與不加Benzonase全能核酸酶的細(xì)菌裂解液相比粘度降低37%。

采用混纖膜(MCE)和聚醚砜膜(PES)，孔徑分別為0.4μm和0.8μm的濾膜進(jìn)行澄清測(cè)試，不加Benzonase全能核酸酶的細(xì)菌裂解液幾乎立即堵塞了濾膜，而終濃度為25U/ml的Benzonase全能核酸酶處理過(guò)的細(xì)菌裂解液，在過(guò)濾時(shí)間為20s 后，0.8μm孔徑的膜通量可以達(dá)到7400L/m2h，0.45μm孔徑的膜通量可以達(dá)到4200L/m2h。對(duì)于孔徑較小的0.22μm濾膜，即使在用25U/ml Benzonase全能核酸酶消化后，過(guò)濾時(shí)也會(huì)立即發(fā)生堵塞，如果一定需要使用0.22μm濾膜過(guò)濾細(xì)菌裂解 液，建議先用聚醚砜膜(PES)材質(zhì)0.45μm孔徑的濾膜過(guò)濾后再用0.22μm濾膜過(guò)濾，或者需要加大酶的用量或延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

7. 提高包涵體蛋白復(fù)性率：

在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)重組蛋白的方法，因其表達(dá)量高、蛋白純度高、免受蛋白酶降解和可表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞有毒的蛋白而廣泛應(yīng)用。在包涵體蛋白變性后復(fù)性，即重折疊的過(guò)程中，由于細(xì)菌裂解液中大量的DNA可能會(huì)粘附蛋白酶，導(dǎo)致目的蛋白的降解，如果在細(xì)菌裂解液中加入終濃度為1U/ml Benzonase全能核酸酶，37oC反應(yīng)30min，即可有效降低由于基因組DNA而粘附的蛋白酶，提高包涵體的純度，最終提高包涵體蛋白復(fù)性率。

8. 二維凝膠電泳樣品的制備：

二維凝膠電泳用于分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物，分辨率高。核酸是帶負(fù)電荷的分子，可以與蛋白質(zhì)表面帶正電荷的區(qū)域相互作用形成復(fù)合物，這種核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成和形狀很難預(yù)測(cè)。與純蛋白質(zhì)相比，這些核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電場(chǎng)中的 遷移方式不同，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)條帶偏移，使二維凝膠電泳的分辨率差。如果按照每100μl細(xì)胞裂解液加入50U的 Benzonase全能核酸酶對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，可減少水平條紋，顯著提高二維凝膠電泳分離的分辨率。另外，因?yàn)樗杳噶枯^少，所以無(wú)需擔(dān)心Benzonase全能核酸酶的使用對(duì)二維凝膠電泳的結(jié)果的影響。

注意事項(xiàng)：

1.     本產(chǎn)品不建議-80oC保存，凍融可能會(huì)降低本產(chǎn)品的酶活性。

2.     Mg²⁺是Benzonase全能核酸酶的關(guān)鍵催化輔助因子，反應(yīng)緩沖液含有1-2mM Mg2+對(duì)Benzonase全能核酸酶的活性是必須的。

3.     參照最適范圍和有效范圍表格，若使用的溶液較為特殊，如為高鹽溶液，或偏酸性、偏堿性，或含有較高濃度的去垢劑、變性劑等，應(yīng)適當(dāng)增加Benzonase全能核酸酶的用量或孵育時(shí)間。

4.     本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

5.     為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

1.     在使用過(guò)程中，應(yīng)在哪一步加入Benzonase全能核酸酶？

如果“使用說(shuō)明”中沒(méi)有相應(yīng)的操作，一般是在培養(yǎng)后、捕獲樣品步驟之前添加。

2.     在低溫條件下，應(yīng)在加入多少Benzonase全能核酸酶？

溫度低于37oC時(shí)，BeyoZonase?超級(jí)核酸酶的效率會(huì)降低，通常情況下，在不增加Benzonase全能核酸酶使用量的情況 下，可以通過(guò)延長(zhǎng)孵育時(shí)間來(lái)補(bǔ)償?shù)蜏貢r(shí)的酶切效率低。

3.     為什么Benzonase全能核酸酶不起作用？什么會(huì)抑制Benzonase全能核酸酶的活性？

Benzonase全能核酸酶在很寬泛的條件下都有酶活性，但是Mg²⁺是Benzonase全能核酸酶的關(guān)鍵催化輔助因子，反應(yīng)液含有1-2mM Mg²⁺對(duì)Benzonase全能核酸酶的酶活性是必須的。Mn²⁺可以替代Mg²⁺，但是只有在Mg²⁺存在的情況下， 酶才能達(dá)到最佳的活性。如果陽(yáng)離子濃度>300mM、磷酸鹽濃度>100mM、硫酸銨濃度>100mM或者>1mM EDTA的情況下，Benzonase全能核酸酶的酶活性會(huì)受到抑制。

4.     為什么Benzonase全能核酸酶的酶活性下降？

通常來(lái)說(shuō)Benzonase全能核酸酶是十分穩(wěn)定的，在極少數(shù)情況下酶活性下降。不可逆的酶失活可能是由于樣品中存在變 性劑、蛋白酶或者-80oC凍融；可逆的酶失活可能是因?yàn)榇嬖隍蟿?如EDTA)或去除了Benzonase全能核酸酶的關(guān)鍵催化輔助因子Mg²⁺。

5.     如何抑制Benzonase全能核酸酶的酶活性？

在陽(yáng)離子濃度>300mM、磷酸鹽濃度>100mM、硫酸銨濃度>100mM或者>1mM EDTA的情況下，Benzonase全能核酸酶的酶活性會(huì)受到抑制，但這些都是可逆的酶失活。只有在極端條件下(100mM NaOH，70oC處理30min)才能實(shí)現(xiàn)不可逆的酶失活。

6.     Benzonase全能核酸酶是否具有蛋白酶活性？

否。Benzonase全能核酸酶沒(méi)有檢測(cè)到蛋白酶活性，因此在其“工作”期間不會(huì)降解目的蛋白。但是如果樣品中存在蛋白酶，可能會(huì)導(dǎo)Benzonase全能核酸酶的不可逆降解。

7.     Benzonase全能核酸酶是否與蛋白酶抑制劑兼容？

是。但是，由于許多蛋白酶抑制劑中含有EDTA，而>1mM EDTA的情況下Benzonase全能核酸酶的酶活性會(huì)受到抑制， 因此應(yīng)謹(jǐn)慎使用。