Dispase II (neutral protease, grade II)

分散酶（中性蛋白酶）

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

中性蛋白酶（Neutral protease），商業(yè)名稱Dispase II，也稱分散酶II，普遍用于不同組織和器官中的細(xì)胞分離。Dispase II是一種非特異性金屬蛋白酶，能快速有效且溫和的破壞組織細(xì)胞外基質(zhì)釋放單細(xì)胞培養(yǎng)物（原代細(xì)胞培養(yǎng)物）或收集已培養(yǎng)的細(xì)胞將其轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基質(zhì)上（傳代培養(yǎng)）。另外，還能預(yù)防懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生的成團(tuán)現(xiàn)象。Dispase II極其穩(wěn)定，不會(huì)受溫度、pH和血清內(nèi)容物的干擾；通過(guò)螯合劑或稀釋很容易失活；酶活溫和，對(duì)細(xì)胞損傷小，可良好維持細(xì)胞膜完整性。

本品來(lái)源于多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa），無(wú)支原體或其他動(dòng)物病毒污染。以非無(wú)菌的凍干粉形式提供，比活力≥0.8 U/mg蛋白，使用前需進(jìn)行除菌。常用工作濃度范圍為0.6-2.4 U/ml。

產(chǎn)品特性:

1） EC NO：3.4.24.4

2） 同義名：Neutral protease中性蛋白酶

3） 比活力：≥0.8 U/mg protein (37℃, casein as substrate, pH 7.5)

4） 酶活力單位定義：在37℃，pH 7.5的反應(yīng)條件下，1min內(nèi)釋放福林酚陽(yáng)性反應(yīng)氨基酸和多肽量相當(dāng)于1 μmol (181 μg)酪氨酸所需的酶量即為一個(gè)活力單位。

5） 最佳pH：6.0 - 8.5

6） 激活劑：最佳Ca2+為2mM，該酶已含足量Ca2+確保最佳酶活力。

7） 抑制劑： EDTA, EGTA, Hg2+,以及其他重金屬。該酶活性不受血清干擾。

保存條件: 

2-8℃干燥保存，至少1年有效。

產(chǎn)品使用：

一、儲(chǔ)存液和工作液制備

1）儲(chǔ)存液制備：用Hepe緩沖鹽溶液（50 mM Hepes/KOH pH7.4, 150 mM NaCl）溶解Dispase II凍干粉，配制成10mg/ml的儲(chǔ)存液，用0.22μM濾膜過(guò)濾除菌。本儲(chǔ)存液置于2-8℃，2周穩(wěn)定；根據(jù)單次用量分裝凍存，高達(dá)2個(gè)月穩(wěn)定，避免反復(fù)凍融。

2）工作液制備：使用時(shí)用合適的細(xì)胞培養(yǎng)液將儲(chǔ)存液稀釋到工作液濃度即可，常用工作濃度為0.6-2.4 U/ml。不推薦使用>2.4 U/ml的工作濃度。具體使用濃度請(qǐng)根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系或參考文獻(xiàn)來(lái)調(diào)整。

二、組織分離

1）用無(wú)菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4mm小片，之后用無(wú)菌PBS緩沖液清洗組織片幾次；

2）用Dispase II工作液（0.6-2.4 U/ml）浸沒(méi)并37℃孵育進(jìn)行組織解離；

3）置于水平搖床上，低速轉(zhuǎn)動(dòng)，37℃孵育直至組織完全解離；【注意】：第一次使用Dispase II，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定總反應(yīng)時(shí)間。對(duì)于堅(jiān)硬致密組織需要1h的孵育時(shí)間，不過(guò)孵育時(shí)間幾小時(shí)也不會(huì)有副作用。

4）若有需要，將消化產(chǎn)物用無(wú)菌不銹鋼網(wǎng)過(guò)篩，從而分離解散細(xì)胞和殘留組織，或當(dāng)更大片段組織靜置到管底，輕輕倒出上層細(xì)胞。若需要進(jìn)一步解離，則加入新鮮的Dispase II工作液到殘留組織。

5）低速離心收集細(xì)胞，吸掉酶工作液；

6）用適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，置于正常預(yù)優(yōu)化條件下培養(yǎng)。

三、細(xì)胞亞培養(yǎng)

1）用37℃預(yù)熱的Dispase II工作液完全覆蓋細(xì)胞，置于37℃孵育5min；

2）吸掉溶液，于37℃再孵育10min；

3）顯微鏡觀察以確定消化情況，若有需要，可再孵育15min；

4）用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，低速離心并用培養(yǎng)基清洗細(xì)胞幾次；

5）用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；

6）按照常規(guī)方法進(jìn)行分盤(pán)傳代。

注意事項(xiàng)：

1.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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