Alamar Blue 阿爾瑪藍細胞增殖及毒性檢測試劑

產品簡介：

阿爾瑪藍（Alamar Blue）是一種細胞活力檢測試劑，包含一種具細胞膜滲透性、無毒性且弱藍色熒光的指示劑，即刃天青（resazurin）。自從1993年開始刃天青就作為一種值得信賴和可靠的試劑被引用。阿爾瑪藍是MTT（噻唑蘭）的有效且無毒替代物。阿爾瑪藍能定量檢測人、哺乳動物、細菌、真菌和支原體細胞的增殖情況，也能用于細胞因子生物活性、細胞活力分析、體外細胞毒性確定以及細胞生長監測。

阿爾瑪藍的工作原理在于：刃天青是一種氧化還原（REDOX）指示劑，根據細胞代謝還原情況發生顏色變化。氧化態的刃天青呈紫藍色且基本無熒光，其還原態產物試鹵靈（resorufin）轉變為粉紅色且高度熒光，產生的熒光強度與呼吸活細胞數量呈正比。通過檢測呼吸過程中氧化水平，阿爾瑪藍用作一種定量檢測細胞活力和毒性的直接指示劑。阿爾瑪藍的顏色變化可通過普通分光光度計檢測吸光度變化，檢測波長為570nm，參考波長為600nm；阿爾瑪藍的熒光變化可通過熒光光度計檢測，激發波長在530~560nm之間，發射波長為590nm。

與臺盼藍、TTC、MTT、MTS等分析法相比，阿爾瑪藍為單一試劑，可連續快速的檢測細胞的增殖情況。阿爾瑪藍對細胞無毒無害，不會干擾電子傳遞鏈，不會干擾細胞呼吸或功能，也不會影響細胞的抗體合成與分泌等活性，因此適用于對同一批細胞的增殖情況進行連續觀察和更進一步的觀察，具有操作簡便和幾乎不干擾正常代謝的特征。

保存條件: 

4℃避光保存，至少一年有效。

產品使用：

一、標準曲線制作（最佳孵育時間和細胞密度的測定）

1. 收集對數生長期的細胞并進行細胞計數。每孔接種100μl細胞懸液，按比例依次用培養基等比稀釋成濃度梯度，一般做3-5個濃度梯度，每個濃度做3-6個復孔。注意要設置陰性對照（細胞培養基中不加入細胞）和陽性對照（只加100μl 100%還原態Alamar Blue，不含細胞）。

2. 每孔加入10μlAlamar Blue，陽性對照孔加入10μl無菌超純水。

3. 將平板放回細胞培養箱孵育。接下來的6-8h內每隔1h取出平板并測定熒光/吸光值。建議平板孵育過夜并測定第24h的熒光/吸光值，得到以下兩組數據：

a）在任何選定的孵育時間內，與細胞數量相關的細胞密度對Alamar Blue還原水平通過線性反應來確定；

b）在任何選定的細胞密度上，測定隨著對照細胞所需時間將Alamar Blue從氧化態（藍色）轉化為完全還原態（紅色）來確定所需的孵育時間；

4.推薦用熒光分光光度計檢測，激發光波長在530-560 nm之間，發射光波長為590 nm。或者用普通分光光度計在570nm測定吸光值，參考波長600nm。也可用570/630nm和540/600nm替代。

5.計算在每個特定細胞密度或孵育時間上Alamar Blue的還原率。

a）公式 1：通過吸光值來計算還原率

Alamar Blue還原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-（E600′×C570）] ×100

E600=氧化態Alamar Blue在600nm波長的消光系數；

E570=氧化型Alamar Blue在570nm波長的消光系數；

A600=檢測孔在600nm波長的吸光值；

A570=檢測孔在570nm波長的吸光值；

E570′=還原態Alamar Blue在570nm波長的消光系數；

E600′=還原態Alamar Blue在600nm波長的消光系數；

C570=陰性對照孔在570nm波長的吸光值（不加細胞的培養基+Alamar Blue）；

C600=陰性對照孔在600nm波長的吸光值（不加細胞的培養基+Alamar Blue）；

 表 1. 阿爾瑪藍（Alamar Blue）在不同波長下的消光系數

b）公式 2：通過熒光值來計算還原率

Alamar Blue 還原率（％）=（實驗組 FI 590-陰性對照組 FI 590）/（100%還原態 Alamar Blue 陽性對照 FI 590-陰性對照組 FI 590）×100

FI 590=590nm 發射波長（560nm 激發波長）下的熒光強度；

6. 繪制在每個特定細胞密度或孵育時間 Alamar Blue 的還原率:

a）對確定最佳細胞密度的實驗，以細胞密度的對數（log）為 x 坐標，Alamar Blue 還原率為縱坐標；

b）對確定最佳孵育時間的實驗，以孵育時間為 x 坐標，Alamar Blue 還原率為縱坐標；

c）根據以上曲線圖來確定最佳細胞密度或孵育時間。

二、細胞毒性和細胞增殖檢測

1. 收集對數生長期的細胞并進行細胞計數。調整細胞數為 1×10⁴ 個/ml（建議細胞密度），每孔接種 100μl細胞懸液。最佳細胞密度需根據細胞類型決定。

2. 細胞鋪板，并加入待檢測藥物。為了確定藥物對細胞生長影響，需設置合適的對照組，包括刺激和無刺

激細胞組。

3. 振蕩混勻，放入細胞培養箱內孵育一段時間。

4. 無菌條件下每孔加入 10μl Alamar Blue。陽性對照孔中加入 10μl 無菌的超純水。

5. 放入細胞培養箱內孵育 4-8h，最佳孵育時間取決于細胞類型。

6. 使用光度計測定細胞毒性或增殖情況。

7. 推薦用熒光分光光度計檢測，激發光波長在 530-560 nm 之間，發射光波長為 590 nm。或者用普通分光光度計在 570nm 測定吸光值，參考波長 600nm。使用培養基為空白對照。

8. 計算細胞毒性和增殖實驗下對照細胞和處理細胞間 Alamar Blue 還原度的變化百分比。

a）公式 3：通過吸光值來計算還原度的變化百分比:

Alamar Blue還原度變化百分比（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[( E600×P570)-（E570×P600）] ×100

E600=氧化態 Alamar Blue 在 600nm 波長的消光系數；

E570=氧化態 Alamar Blue 在 570nm 波長的消光系數；

A600=檢測孔在 600nm 波長的吸光值；

A570=檢測孔在 570nm 波長的吸光值；

P570=陽性對照孔在 570nm 波長的吸光值（不含待測藥物的細胞+ Alamar Blue）;

P600=陽性對照孔在 600nm 波長的吸光值（不含待測藥物的細胞+ Alamar Blue）;

結果判斷：假如 Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=62%，說明相對于對照孔，檢測孔 Alamar Blue 的還原變化值為 62%，換句話而言，相對于對照孔，38%的檢測孔細胞生長受到抑制。

表 1. 阿爾瑪藍（Alamar Blue）在不同波長下的消光系數

b）公式 4：通過熒光值來計算還原度的變化百分比

Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=（實驗組 FI 590/陰性對照組 FI 590）×100

FI 590=590nm 發射波長（560nm 激發波長）下的熒光強度；

結果判斷：假如 Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=25%，說明相對于對照孔，檢測孔 Alamar Blue 的還原變化值為 25%，換句話而言，相對于對照孔，75%的檢測孔細胞生長受到抑制。

注意事項：

1.      還原態的Alamar Blue在水或水溶性緩沖液如PBS中很不穩定，但在培養基內非常穩定。為了確定特定實驗還原態Alamar Blue的吸光度/熒光值，需準備100%還原態Alamar Blue試劑：將Alamar Blue與細胞培養基按照1:10的比例混合，高壓滅菌15min即可。

2.      適宜的細胞密度能夠增加檢測靈敏度。對于96孔板，建議每孔接種100μl細胞，細胞濃度范圍：貼壁細胞為100-10,000個/孔，懸浮細胞在2,000-50,000個/孔，以培養基為空白對照。對于384孔板，細胞濃度和接種量均減半。

3.      影響細胞對Alamar Blue反應的兩大變量為孵育時間和鋪板密度，建議實驗前需先摸索優化這兩個因素。細胞密度過高或孵育時間過長都會導致繼發性還原反應，紅色產物停止增加并開始衰減，導致吸光度/熒光水平明顯下跌并伴隨紅色消失。

4.      微生物污染會還原Alamar Blue。因此對被污染細胞使用Alamar Blue檢測會引起錯誤結果。

5.      Alamar Blue可以用分光光度計或熒光計檢測，但熒光靈敏度高，實驗誤差小，推薦熒光檢測。

6.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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