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總RNA提取試劑盒（離心柱法）

產品介紹 

本試劑盒采用離心吸附柱技術和新型的溶液體系，為客戶提供一套從動物組織、植物組織、培養細胞、細菌中純化完整、高質量總RNA。試劑盒 采用獨特的緩沖液系統，快速裂解細胞，沉淀蛋白，高效專一吸附核酸分子，再經DNA酶I處理去除基因組DNA，最終得到純度高，完整性好的 總RNA。可用于RT-PCR、Real-Time PCR、芯片分析、Northern雜交等多種下游實驗。

注意事項

1 使用前檢查各組分是否出現沉淀。若有，請輕輕搖晃混合均勻，或37℃水浴重新溶解。 

2 β-巰基乙醇請4℃保存，使用前在RNA裂解液中加入800μlβ-巰基乙醇至終濃度為4%，加入β-巰基乙醇的RNA裂解液于4℃保存，有效期6個 月。 

3 戴一次性干凈手套和口罩操作，防止皮膚、唾液和實驗室用品上存在的RNase污染。 

4 使用無菌無RNase的塑料制品和槍頭。 

5 若使用玻璃器皿須經過0.1% DEPC水在37℃下浸泡12小時，然后經過 121℃高壓滅菌30分鐘，烘干后使用。 

6 配制相關的試劑必須使用經過121℃高壓滅菌的0.1% DEPC水。

使用流程

樣品預處理

1 組織樣品 

取10-20mg動物組織，置于液氮中研磨成粉末，立即加入200μl RNA裂解液（已加入 β-巰基乙醇），也可將組織置于離心管中，迅速加入200μl RNA裂解液，用普通玻璃勻漿器或者電動勻漿器將組織徹底研磨均勻。

2 細胞樣品 

收集1-5×106個細胞。對于貼壁細胞，加入200μl RNA裂解液。用移液器反復吹打混勻直至細胞團消化不見為止，轉移到干凈的離心管內。對于懸浮細胞：常規桌面離心機5000rpm（約3056g）離心5min，收集細胞，每1-5×106個細胞加入200μl RNA裂解液。用移液器反復吹打混勻直至 看不到細胞團為止。

3 植物組織樣品

將液氮研磨好的粉末立即轉移到RNA裂解液中，按照每10-20mg加入200μl RNA裂解液，用移液器吹打均勻至無明顯的粉末團。

4 細菌樣品

用100μl新鮮配制的含溶菌酶的TE緩沖液重懸細菌沉淀。革蘭氏陽性細菌可使用3mg/ml(終濃度)的溶菌酶，輕輕混勻，室溫孵育5-10min，加 入200μl RNA裂解液，用槍頭吹打混勻；革蘭氏陰性細菌則采用0.4mg/ml(終濃度)的溶菌酶，輕輕敲打混勻，室溫孵育3-5min。加入200μl RNA裂解液，用槍頭吹打混勻。

RNA 提取

1 向預處理好的樣品勻漿液中加入400μl RNA中和液，混勻。室溫放置3-5min。如果動物組織樣品來源比較珍貴，可以選擇裂解物加入 400μl RNA 中和液后置于70℃加熱5min，提高RNA得率。

2 室溫，常規桌面離心機12,000rpm（~13,400×g）離心1min，小心吸取上清液到新的1.5ml無核酸酶的EP管中。

3 加入 1/2 倍上清體積的無水乙醇，用移液槍吹打3-4次以混勻。

4 將混合液全部轉移到RNA吸附柱RP20內（吸附柱位于收集管內），如果混合液體積大于800μl，需分批加入。每次加入的體積不超過800 μl。12,000rpm（~13,400×g）離心 1min，棄濾液。將RNA吸附柱放入收集管中。

5 向RNA吸附柱中加入600μl RNA洗滌液 I（已加入無水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）離心1min，棄濾液。將RNA吸附柱放入收集管中。

6 按如下比例配制DNase I反應混合液，并輕輕混勻。

7 向 RNA 吸附柱膜中央加入50μl新鮮配制的DNase I反應混合液，室溫靜置15min。

8 向 RNA 吸附柱中加入600μl RNA洗滌液 II（已加入無水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）離心1min，棄濾液。

9 重復步驟8 一次。將RNA吸附柱放入收集管中，12,000rpm（~13,400×g）離心2min ，目的是甩干管壁上殘留的RNA洗滌液 II，避免殘留的乙醇影響下游實驗。

10 將 RNA 吸附柱轉移至洗脫管中，向RNA吸附柱膜中央加入50-100μl無核酸酶水，室溫靜置2min，12,000rpm（~13,400×g）離心 1min，即得總RNA產物，如不立即進行下游實驗，將RNA保存在-80℃備用。

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