外泌體提取純化試劑盒-柱法（細(xì)胞上清）

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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

外泌體是由細(xì)胞分泌的包含 RNA和蛋白質(zhì)的小囊泡（30-150 nm），在血液、唾液、尿液及乳汁等體液中大量存在。外泌體被認(rèn)為具有細(xì)胞間信使的功能，在特定細(xì)胞之間傳遞它們的效應(yīng)物或信號(hào)分子；然而其構(gòu)造、效應(yīng)物組成以及所參與的生物學(xué)通路目前尚不明晰。

外泌體的生物學(xué)功能研究中需要分離完整的外泌體顆粒，而傳統(tǒng)超速離心方法步驟繁瑣、硬件要求高、操作難度大。由本公司自主開發(fā)的外泌體提取純化試劑盒，適用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液（也可用于尿液）中的外泌體提取純化，5T可以提取100ml細(xì)胞上清液。試劑盒采用陰離子交換色譜法原理，與被分離樣品中帶負(fù)電荷的外泌體相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)外泌體的分離。該試劑盒具有快速、高效、獲得的外泌體純度高等特點(diǎn)，可用于電鏡分析、NTA粒徑分析、核酸分析、蛋白分析、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等。

保存條件: 

室溫保存，2年有效。

產(chǎn)品組成：

* Nuclease-free, Sterile

自備材料：

高速離心機(jī)，0.45 μm或0.22 μm過濾器， 100 KD 超濾柱、鐵架臺(tái)。

產(chǎn)品使用：

一、 樣品預(yù)處理

1.      取樣：如果是凍存樣品，從冰箱取出后置于4℃解凍，融化后置于冰上；如果是新鮮樣品，收集樣品后直接置于冰上；

2.      樣品處理量（單個(gè)柱子處理量）：

注：每個(gè)“Exosome Extraction Column”處理量 10~20 mL（未經(jīng)濃縮的原始上清），樣品過少可能導(dǎo)致獲得的外泌體濃度低，樣品過多可能導(dǎo)致堵柱。

3.      離心去細(xì)胞：樣品于4℃以300 ×g（~1,640 rpm**） 離心5 min，去除樣品中的細(xì)胞； **為約10 cm有效離心半徑的大離心機(jī)換算（≥15 mL離心管），下同。

4.      離心去細(xì)胞碎片：將去除細(xì)胞后的樣品于4℃以3,000 ×g（~5,200 rpm**）離心10 min，去除樣品中的細(xì)胞碎片（注：若沉淀較多，可3,000 ×g，10 min離心多次至無明顯沉淀，每次取離心上清液）；

5.      上清液過濾：去除細(xì)胞碎片的離心上清液用 0.45 μm 或0.22 μm過濾器過濾至新的容器中。

二、 提取前準(zhǔn)備

1.      固定外泌體提取柱（Exosome Extraction Column）：取出提取柱，將提取柱上下篩板取下后垂直固定于試管架或鐵架臺(tái)上，待填料保存液自然流盡；

2.      加入Solution A溶液：填料保存液流盡后沿柱子內(nèi)壁緩慢加入5 mL Solution A溶液，待Solution A溶液自然流盡；

3.      加入Solution B溶液：Solution A流盡后沿柱子內(nèi)壁緩慢加入5 mL Solution B溶液，待 Solution B溶液 自然流盡，等待上樣。

三、 提取外泌體

1.      過柱：將經(jīng)0.45 μm或0.22 μm過濾器過濾后的細(xì)胞上清液沿柱子內(nèi)壁緩慢多次加入提取柱中，待細(xì)胞上清液自然流盡（注：每個(gè)“Exosome Extraction Column”上樣量10~20 mL（未經(jīng)濃縮的原始上清），樣品過少可能導(dǎo)致獲得的外泌體濃度低，樣品過多可能導(dǎo)致堵 柱）；

2.      平衡：細(xì)胞上清液流盡后沿柱子內(nèi)壁緩慢多次加入 15 mL Solution B 溶液，待Solution B溶液自然流盡；

3.      洗雜：Solution B溶液流盡后沿柱子內(nèi)壁緩慢加入 0.8 mL Solution C 溶液，待Solution C溶液自然流盡；

4.      洗脫：待上步驟中Solution C溶液流盡后沿柱子內(nèi)壁再次緩慢加入1 mL Solution C溶液，收集該流穿液（該流穿液中富含外泌體顆粒）；

5.      濃縮（選做）：若外泌體濃度過低，可用100 KD超濾柱將流穿液適當(dāng)濃縮；

6.      純化外泌體：將收獲的外泌體顆粒粗品轉(zhuǎn)入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃以 3,000 ×g（~6,200 rpm*）離心10 min，離心后收集EPF 柱管底的液體，此液體即為純化后的外泌體（注：EPF 柱不可重復(fù)使用）；

*為約7 cm有效離心半徑的小離心機(jī)換算（≤2 mL離心管）。

7.      外泌體的保存：純化后的外泌體以合適體積進(jìn)行分裝凍存于-80℃低溫冰箱中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

注意事項(xiàng)：

1.      新的Exosome Extraction Column柱子的上篩板和填料表面之間可能存在一定的空隙，該現(xiàn)象是運(yùn)輸過程中晃蕩造成的，并不影響其性能，實(shí)驗(yàn)前將篩板向下推動(dòng)至填料表面即可；

2.      Exosome Extraction Column 和 Exosome Purification Filter 均為一次性耗材，請(qǐng)勿重復(fù)利用，否則可能會(huì)造成堵柱而損失樣品；

3.      Solution C 為 Tris 緩沖鹽溶液；

4.      流穿液呈紅色，是由于培養(yǎng)基中色素和外泌體同時(shí)被洗脫所致，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。若需去除色素，可使用100 KD超濾柱置換緩沖液；

5.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅用于生命科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷及其他用途！

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