輔酶Ⅰ NAD+/NADH含量測定試劑盒 微板法

產品簡介：

煙酰胺核苷酸的測定一直是細胞或組織在能量轉化和氧化還原狀態方面的研究熱點。 NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環（TCA）的主要氫受體，其NAD+/NADH比值的高低不僅可用于評價糖酵解和TCA循環的強弱，而且在生物物質合成和抗氧化代謝中具有重要調控作用。

本試劑盒提供一種方便，快速的檢測方法，提供特異性提取液分別提取樣品中的NAD+和NADH，NADH在遞氫體作用下與一種高靈敏度的顯色劑反應生成黃色水溶性甲瓚，在 450nm下檢測，得到NADH含量。利用乙醇脫氫酶特異性還原NAD+為NADH，從而檢測NAD+含量。

保存條件: 

-20℃保存，三個月有效。

產品組成：

產品使用：

建議正式實驗前，選取2個樣本做預測定，了解實驗樣品情況，熟悉流程，避免樣本和試劑浪費。

一、樣本準備：

1. 組織樣本準備：

(a) NAD+的提取：

取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液A，冰浴研磨，全部轉移到離心管中（用提取液A補齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動物樣本于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V1體積的提取液B中和（可分次添加提取液B，調至PH約中性，記錄提取液B加入體積為V1）；12000rpm，4℃離心5min，取上清液置于冰上待測。

(b) NADH的提取：

取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部轉移到離心管中（用提取液B補齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動物樣本于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V2體積的提取液A中和（可分次添加提取液A，調至PH約中性，記錄提取液A加入體積為V2）；12000rpm，4℃離心5min，取上清液置于冰上待測。

【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增加到0.2g等，可做幾個梯度選擇適合本次實驗的樣本量。

2. 細菌/細胞樣本準備：

(a) NAD+的提取：

先收集細胞或細菌到離心管內：取約5×10⁶個細菌或細胞加入1ml提取液A，冰浴研磨， 全部轉移到離心管中（用提取液A補齊到1mL），于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或 放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V1體積的提取液B中和（可分次添加提取液B，調至PH約中性，記錄提取液B加入體積為V1）；12000rpm，4℃離心5min，取上清液置于冰上待測。

(b) NADH的提取：

先收集細胞或細菌到離心管內：取約5×10⁶個細菌或細胞加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部轉移到離心管中（用提取液B補齊1mL），于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V2體積的提取液A中和（可分次添加提取液A，調至PH約中性，記錄提取液A加入體積為V2）；12000rpm 4 ℃離心5min，取上清置于冰上待測。

【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增至1×10⁷個等，可做幾個梯度選適合本次實驗的樣本量。

3. 液體樣本準備：

(a) NAD+的提取：

在離心管中加入約0.1mL液體樣本，然后再加入1mL提取液A（用提取液A補齊到1.1mL）， 于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL 上清液至新離心管中，再加V1體積的提取液B中和（可分次添加提取液B，調至PH約中性， 記錄提取液B加入體積為V1）；12000rpm4℃離心5min，取上清置冰上待測。 (b) NADH的提取：

在離心管中加入約0.1mL液體樣本，然后再加入1mL提取液B（用提取液B補齊到1.1mL）， 于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL 上清液至新離心管中，再加V2體積的提取液A中和（可分次添加提取液A，調至PH約中性， 記錄提取液A加入體積為V2）；12000rpm 4℃離心5min，取上清液置于冰上待測。

【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增至0.5mL等，可做幾個梯度選擇適合本次實驗的樣本量。

二、樣品測定 ：

1. 酶標儀預熱30min 以上，溫度設定37℃，調節波長至450nm。

2. 在96孔板中依次加入：

【注】若ΔA過小，可加大樣本取樣質量W；或增加樣本量V1（由20增至40μL，則試劑三相應減少），或延長反應時間（如：60min或更長）；則改變后的相應變量需代入計算公式重新計算。

三、含量計算：

1. 標準曲線：y=4.2609x-0.0071：x是NADH摩爾質量（nmol），y 是ΔA。

2. NAD+含量的計算：

(1) 按樣本鮮重計算：

NAD+(nmol/g 鮮重）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(W÷2×V÷V3)

=23.47×(△A+0.0071)×(0.5+V1)÷W

(2) 按細菌或細胞密度計算：

NAD+(nmol/10⁴cell）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(500÷2×V 樣÷V3)

=0.047×(△A+0.0071)×(0.5+V1)

(3) 液體中NAD+含量計算：

NAD+含量(nmol/mL）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(V 液÷2×V 樣÷V3)

=234.7×(△A +0.0071)×(0.5+V1)

3. NADH含量的計算：

(1) 按樣本鮮重計算：

NADH(nmol/g 鮮重）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(W÷2×V÷V4)

=23.47×(△A+0.0071)×(0.5+V2)÷W

(2) 按細菌或細胞密度計算：

NADH(nmol/10⁴ cell）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(500÷2×V÷V4)

=0.047×(△A+0.0071)×(0.5+V2)

(3) 液體中NADH含量計算：

NADH含量(nmol/mL）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(V 液÷2×V樣÷V4)

=234.7×(△A+0.0071) ×(0.5+V2)

V樣----加入反應體系中樣本體積，0.02mL

V液----所取液體樣本體積：0.1mL

V3---NAD+提取液體積，0.5mL提取液A+V1mL提取液B=（0.5+V1）mL

V4---NADH 提取液體積，0.5mL提取液B+V2mL提取液A=（0.5+V2）mL

W----樣本質量，g

500----細胞或細菌總數，500萬

NADH分子量----663.4

附：標準曲線制作過程：

1. 制備標準品母液（1μmol/mL）：向標準品離心管里面加入1.41mL蒸餾水（NADH不太穩定，取出NADH后請盡快使用。如果發現標準曲線不理想，很有可能是標準品發生了降解）。 

2. 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0，1，2，3，4，5 nmol/mL。也可根據實際樣本來調整標準品濃度。

3. 依據測定管的加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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