輔酶Ⅱ NADP+/NADPH含量測(cè)定試劑盒 微板法

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

煙酰胺核苷酸的測(cè)定一直是細(xì)胞或組織在能量轉(zhuǎn)化和氧化還原狀態(tài)方面的研究熱點(diǎn)。 NADP+和NADPH含量測(cè)定可以計(jì)算NADP（NADPH+NADP+)含量和NADPH/NADP+比值。NADP+ /NADPH 比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一，而且其變化在磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)中具有重要調(diào)控作用。

本試劑盒提供一種方便，快速的檢測(cè)方法，提供特異性提取液分別提取樣品中的NADP+ 和NADPH，NADPH在遞氫體作用下與一種高靈敏度的顯色劑反應(yīng)生成黃色水溶性甲瓚，在 450nm下檢測(cè)，得到NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶特異性還原NADP+為NADPH，從而檢測(cè)NADP+含量。

保存條件: 

-20℃保存，三個(gè)月有效。

產(chǎn)品組成：

【注】：粉劑量在mg級(jí)別，使用前用手甩幾次或者進(jìn)行離心，打開直接加入要求的試劑即可。

產(chǎn)品使用：

建議正式實(shí)驗(yàn)前，選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解實(shí)驗(yàn)樣品情況，熟悉流程，避免樣本和 試劑浪費(fèi)！

一、樣本準(zhǔn)備

1. 組織樣本：

(a) NADP+的提取：

取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液A，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到離心管中（用提取液A補(bǔ)齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動(dòng)物樣本于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V1體積的提取液中和（可分次添加提取液B，調(diào)至PH約中性，記錄提取液B加入體積為V1）；12000rpm，4℃離心5min，取上清液置于冰上待測(cè)。

(b) NADPH的提取：

取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到離心管中（用提取液B補(bǔ)齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動(dòng)物樣本于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提取液A，調(diào)至PH約中性，記錄提取液A加入體積為V2）；12000rpm，4℃離心5min，取上清液置于冰上待測(cè)。

【注】：若測(cè)出值較低，可加大樣本取樣量，如增加到0.2g等，可做幾個(gè)梯度選擇適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：

(a) NADP+的提取：

先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)：取約5×10⁶個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液A，冰浴研磨， 全部轉(zhuǎn)移到離心管中（用提取液A補(bǔ)齊到1mL），于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或 放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V1體積的提 取液中和（可分次添加提取液B，調(diào)至PH約中性，記錄提取液B加入體積為V1）；12000rpm，4℃離心5min，取上清液置于冰上待測(cè)。

(b) NADPH的提取：

先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)：取約5×10⁶個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液B，冰浴研磨， 全部轉(zhuǎn)移到離心管中（用提取液B補(bǔ)齊1mL），于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放 冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提取液A，調(diào)至PH約中性，記錄提取液A加入體積為V2）；12000rpm 4 ℃離心5min，取上清置于冰上待測(cè)。

【注】：若測(cè)出值較低，可加大樣本取樣量，如增至1×10⁷個(gè)等，可做幾個(gè)梯度選適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。

3. 液體樣本：

(a) NADP+的提取：

在離心管中加入約0.1mL液體樣本，然后再加入1mL提取液A（用提取液A補(bǔ)齊到1.1mL）， 于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V1體積的提取液中和（可分次添加提取液B，調(diào)至PH約中性， 記錄提取液B加入體積為V1）；12000rpm 4℃離心5min，取上清置冰上待測(cè)。 (d) NADPH的提取：

在離心管中加入約0.1mL液體樣本，然后再加入1mL提取液B（用提取液B補(bǔ)齊到1.1mL）， 于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提取液A，調(diào)至PH約中性，記錄提取液A加入體積為V2）；12000rpm4℃離心5min，取上清液置于冰上待測(cè)。 【注】：若測(cè)出值較低，可加大樣本取樣量，如增至0.5mL等，可做幾個(gè)梯度選擇適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量

二、樣品測(cè)定：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，溫度設(shè)定37℃，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm。

2. 在96孔板中依次加入：

【注】若ΔA過(guò)小，可加大樣本取樣質(zhì)量W；或增加樣本量V1（由20增至40μL，則試劑三相應(yīng)減少），或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（如：60min或更長(zhǎng)）；則改變后的相應(yīng)變量需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。

三、含量計(jì)算：

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=13.126x-0.0023，x是NADPH摩爾質(zhì)量（nmol），y 是ΔA。

2. NADP+含量的計(jì)算：

(1) 按樣本鮮重計(jì)算：

NADP+ (nmol/g 鮮重）=[(△A+0.0023)÷13.126]÷(W÷2×V 樣÷V3)

=7.62×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V1)÷W

(2) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

NADP+(nmol/10⁴cell）=[(△A+0.0023)÷13.126]÷(500÷2×V 樣÷V3) =0.015×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V1)

(3) 液體中NADP+含量計(jì)算：

NADP+含量(nmol/mL）=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(V 液÷2×V 樣÷V3) =7.62×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V1)

3. NADPH含量的計(jì)算：

(1) 按樣本鮮重計(jì)算：

NADPH(nmol/g 鮮重）=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(W÷2×V 樣÷V4)

=7.62×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V2)÷W

(2) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

NADPH(nmol/10⁴ cell）=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(500÷2×V 樣÷V4) =0.015×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V2)

(3) 液體中NADPH含量計(jì)算：

NADPH含量(nmol/mL）=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(V 液÷2×V 樣÷V4) =7.62×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V2)

V樣----加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL

V液----所取液體樣本體積：0.1mL

V3---NADP+提取液體積，0.5mL提取液A+V1mL提取液B=（0.5+V1）mL

V4---NADPH 提取液體積，0.5mL提取液B+V2mL提取液A=（0.5+V2）mL

W----樣本質(zhì)量，g

500----細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)

NADPH分子量----745.4

附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程：

1. 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1μmol/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品離心管里面加入1.8mL蒸餾水（NADPH不太穩(wěn)定，取出NADPH后請(qǐng)盡快使用。如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不理想，很有可能是標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生了降解）。

2. 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0，1，2，3，4，5nmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái) 調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

3. 依據(jù)測(cè)定管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

注意事項(xiàng)：

1.      由于NADP+和NADPH很不穩(wěn)定，較易降解，盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2.      當(dāng)僅檢測(cè)NADP+和NADPH的總量或者樣品中的NADPH的量時(shí)，一個(gè)本試劑盒可以進(jìn)行96次檢測(cè)；當(dāng)檢測(cè)NADP+或者NADP+/NADPH的比值時(shí)，一個(gè)本試劑盒可以進(jìn)行48次檢測(cè)。

3.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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