NADH-谷氨酸脫氫酶(NADH-GDH)活性檢測(cè)試劑盒 分光法

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

谷氨酸脫氫酶廣泛分布于生物體中，在氨同化和轉(zhuǎn)化成有機(jī)氮化合物的代謝中起重要作用。其輔酶是NADH或NADPH，在動(dòng)植物種兩種輔酶都有存在，而以NADH-谷氨酸脫氫酶（EC 1.4.1.2）活力為主。

本試劑盒提供一種快速靈敏的檢測(cè)方法，樣品中的NADH-谷氨酸脫氫酶特異性作用于底物谷氨酸并產(chǎn)生NADH，同時(shí)與顯色劑反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，該物質(zhì)在450nm處有最大吸收峰，進(jìn)而得到NADH-GDH的酶活性大小。

保存條件: 

2-8℃保存，三個(gè)月有效。

產(chǎn)品組成：

【注】：粉劑量在mg級(jí)別，使用前用手甩幾次或者進(jìn)行離心，打開直接加入要求的試劑即可。

產(chǎn)品使用：

一、樣本準(zhǔn)備

建議正式實(shí)驗(yàn)前選取2個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)！

1. 組織樣本：

(a) 稱取約0.1g組織，加入1mL提取液，進(jìn)行冰浴勻漿；

(b) 12000rpm 4℃離心 10min，取上清液，置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)胞/細(xì)菌樣本：

(a) 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；

(b) 取5×10⁶個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；

(c) 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

【注】：若增加樣本量，按照每0.5~1×10⁷個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液進(jìn)行提取。

3. 液體樣本：

直接檢測(cè)；若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。

二、樣品測(cè)定

1. 可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 在1mL玻璃比色皿（光徑1cm）中依次加入：

【注】：

1. 若ΔA值小于0.01，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間T（如由15min增至30min或1小時(shí)），或增加加樣體積V1如由160μL增至320μL，則提取液相應(yīng)減少），則改變后的T和V1需要代入計(jì)算公式重新計(jì)算。

2. 若立即讀值導(dǎo)致上升趨勢(shì)不穩(wěn)定，可加完所有試劑混勻后靜置5min后再讀取A1；也可選取一段線性上升的時(shí)間段來參與計(jì)算，相對(duì)應(yīng)的A值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。

三、結(jié)果計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0338x-0.0434，x是NADH摩爾質(zhì)量（nmol），y是ΔA。

2. 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

 NADH-GDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0434)÷0.0338]÷(V1×Cpr)÷T =12.33×(ΔA+0.0434)÷Cpr

3. 按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每克組織每分鐘生成1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

 NADH-GDH(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0434)÷0.0338]÷(W×V1÷V)÷T =12.33×(ΔA+0.0434)÷W

4. 按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞每分鐘生成1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

 NADH-GDH(nmol/min/10⁴ cell)=[(ΔA+0.0434)÷0.0338]÷(500×V1÷V) ÷T =0.025×(ΔA+0.0434)

5. 液體中NADH-GDH活力的計(jì)算：

單位定義：每毫升液體每分鐘生成1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

 NADH-GDH(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0434)÷0.0338]÷V1÷T=12.33×(ΔA+0.0434)

V---加入提取液體積，1mL

V1---加入樣本體積，0.16mL

T---反應(yīng)時(shí)間，15min

W---樣本質(zhì)量，g

500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬

Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL

附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程：

1. 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（0.5nmol/μL）：向標(biāo)準(zhǔn)品離心管里面加入1.41ml蒸餾水（母液需在兩天內(nèi)用且-20℃保存）。

2. 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0，0.04，0.08，0.12，0.16，0.2.nmol/μL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

3. 依據(jù)測(cè)定管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

注意事項(xiàng)：

1.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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