NADH氧化酶(NOX)活性檢測試劑盒 微板法

產(chǎn)品簡介：

NADH氧化酶（NOX，EC1.6.99.3）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生，而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

NOX能夠?qū)?span>NADH氧化為NAD，通過檢測NADH于340nm處的下降速率，即可得出NADH 氧化酶活性的大小。

保存條件: 

-20℃保存，3個月有效。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

建議正式實驗前，選取2個樣本做預測定，了解實驗樣品情況，熟悉流程，避免樣本和試 劑浪費！

一、線粒體制備（提示：整個線粒體的提取過程須保持4℃低溫環(huán)境）

1. 稱取約0.2g組織或收集1000萬細菌/細胞，加入1mL試劑一，用冰浴勻漿器或研缽冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管后于4℃×3000g離心20min；

2. 小心吸取上清液（棄沉淀）移至另一離心管中，4℃×16000g離心20min。用移液器移除上清 液（上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的NOX（此步可選做））。 留下沉淀（沉淀即為線粒體）。

3. 在沉淀（線粒體）中加入200μL試劑二，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲5s，間隔3s，重復30次），液體置于冰上用于線粒體NOX酶活性測定。

【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：2.5~5的比例進行提取，或按照細菌/細胞數(shù)量（10⁴）：提取液（mL）為1000~2000：1的比例進行提取。

二、樣品測定

1. 酶標儀預熱30min以上，設(shè)定溫度25℃，調(diào)節(jié)波長至340nm。

2. 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 3. 在96孔板中依次加入：

【注】若△A小于0.01，可以延長反應(yīng)時間T（如至10min或更長），則改變后的反應(yīng)時間T需代入公式重新計算。

三、含量計算

1. 按樣本蛋白濃度計算：

酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘氧化1nmolNADH定義為一個酶活單位。

 NOX(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×10⁹]÷(V1×Cpr)÷T=643.1×ΔA÷Cpr

2. 按樣本鮮重計算：

酶活定義：每克組織每分鐘氧化1nmolNADH定義為一個酶活單位。

NOX(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×10⁹]÷(W×V1÷V)÷T=128.6×ΔA÷W

3. 按細菌或細胞密度計算：

酶活定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘氧化1nmolNADH定義為一個酶活力單位。

 NOX(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×10⁹]÷(500×V1÷V)÷T=0.26×ΔA

ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm

d---96孔板光徑，0.5cm

V---加入試劑二的體積，0.2mL

V1---加入樣本體積，0.02mL

V2---反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L

T---反應(yīng)時間，5min

W---樣本質(zhì)量，g

500---細胞或細菌總數(shù)，萬

Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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