NAD-蘋(píng)果酸脫氫酶(NAD-MDH)活性檢測(cè)試劑盒

(線粒體和胞質(zhì)) 微板法

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

蘋(píng)果酸脫氫酶廣泛存在于動(dòng)植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，依據(jù)需要的輔酶不同，可分為: NAD-MDH 和NADP-MDH，前者主要存在于線粒體和胞質(zhì)中，后者存在于某些微生物和 植物葉綠體中；蘋(píng)果酸脫氫酶與多條生理代謝途徑密切相關(guān):線粒體的能量代謝、蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。

NAD-MDH(EC1.1.1.37)催化 NADH 還原草酰乙酸生成蘋(píng)果酸，使NADH在340nm處光吸收下降，進(jìn)而通過(guò)340nm處光吸收的下降速率計(jì)算得到NAD-MDH的酶活性大小。

保存條件: 

-20℃保存，三個(gè)月有效。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

建議正式實(shí)驗(yàn)前，選取2個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解實(shí)驗(yàn)樣品情況，熟悉流程，避免樣本和 試劑浪費(fèi)！

一、樣本準(zhǔn)備

1. 組織樣本：

(a) 稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液，進(jìn)行冰浴勻漿；

(b) 12000rpm，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

【注】：若增加樣本量,可按組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例提取

2. 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：

(a) 先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；

(b) 取5×10⁶個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（冰浴，功率200w，超 聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；

(c) 12000rpm，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

【注】：若增加樣本量，可按每0.5~1×10⁷個(gè)細(xì)菌數(shù)量加入1mL提取液的比例進(jìn)行提取。

二、樣品測(cè)定

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，設(shè)定波長(zhǎng)到340nm。 

2. 測(cè)定前將溶解好的試劑一在25℃水浴中孵育10min以上。

3. 在96孔板中依次加入：

【注】：1. 若ΔA在零附近，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T(如增至10min)讀取 A2；或加大樣本量V1(如增至30μL，則試劑二相應(yīng)減少)。改變后的反應(yīng)時(shí)間T或 V1需代入公式重新計(jì)算。

2. 若ΔA大于0.6或A2的值小于0.5，需縮短反應(yīng)時(shí)間時(shí)間T(如減至0.5min)，或減少樣本量 V1(如減至5μL，則試劑二相應(yīng)增加)，則改變后的T和V1 需代入公式重新計(jì)算。

3. 若起始值A1太大如超過(guò)2(顏色較深的植物葉片，一般色素較高則起始值相對(duì)會(huì)偏高),可減少V1(如減至5μL，則試劑二相應(yīng)增加)，則改變后的 V1代入公式重新計(jì)算。或向待測(cè)樣本中加少許活性炭混勻靜置5min后12000rpm,4℃離心10min,上清液用于檢測(cè)。

4. 若下降趨勢(shì)不穩(wěn)定，可以每隔10S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時(shí)間段來(lái)參與計(jì)算，相對(duì)應(yīng)的A值也代入公式重新計(jì)算。

三、結(jié)果計(jì)算

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(V1×Cpr)÷T =6430.9×ΔA÷Cpr

2. 按樣本鮮重計(jì)算：

酶活定義：每克組織在每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V1÷V)÷T=6430.9×ΔA÷W

3. 按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算：

酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V1÷V)÷T=12.86×ΔA

4. 按液體體積計(jì)算：

酶活定義：每毫升液體每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷V1÷T=6430.9×ΔA

V--提取液體積，1mL

V1--加入樣本體積，0.01mL

V2--反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L

ε--NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm

d--光徑，0.5cm

W--樣本質(zhì)量，g

500--細(xì)胞數(shù)量，萬(wàn)

T--反應(yīng)時(shí)間，1min

Cpr--蛋白濃度（mg/mL）

注意事項(xiàng)：

1.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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