NADH-谷氨酸脫氫酶(NADH-GDH)活性檢測試劑盒 微板法

產品簡介：

谷氨酸脫氫酶廣泛分布于生物體中，在氨同化和轉化成有機氮化合物的代謝中起重要作用。其輔酶是NADH或NADPH，在動植物種兩種輔酶都有存在，而以NADH-谷氨酸脫氫酶（EC 1.4.1.2）活力為主。

本試劑盒提供一種快速靈敏的檢測方法，樣品中的NADH-谷氨酸脫氫酶特異性作用于底物谷氨酸并產生NADH，同時與顯色劑反應生成黃色物質，該物質在450nm處有最大吸收峰，進而得到NADH-GDH的酶活性大小。

保存條件: 

2-8℃保存，三個月有效。

產品組成：

【注】：粉劑量在mg級別，使用前用手甩幾次或者進行離心，打開直接加入要求的試劑即可。

產品使用：

一、樣本準備

建議正式實驗前選取2個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗樣本和試劑浪費！

1. 組織樣本：

(a) 稱取約0.1g組織，加入1mL提取液，進行冰浴勻漿；

(b) 12000rpm 4℃離心 10min，取上清液，置冰上待測。

2. 細胞/細菌樣本：

(a) 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；

(b) 取5×10⁶個細菌或細胞加入1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；

(c) 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

【注】：若增加樣本量，按照每0.5~1×10⁷個細菌/細胞加入1mL提取液進行提取。

3. 液體樣本： 直接檢測；若渾濁，離心后取上清檢測。

二、樣品測定

1. 酶標儀預熱30min以上，調節波長至450nm。

2. 在96孔板中依次加入：

【注】：

1. 若ΔA值小于0.01，可以延長反應時間T（如由15min增至30min或1小時），或增加加樣體積V1（如由40μL增至80μL，則提取液相應減少），則改變后的T和V1需要代入計算公式重新計算。

2. 若立即讀值導致上升趨勢不穩定，可加完所有試劑混勻后靜置5min后再讀取A1；也可選取一段線性 上升的時間段來參與計算，相對應的A值也代入計算公式重新計算。

三、結果計算

1. 標準曲線：y=0.0614x-0.0064，x是NADH摩爾質量（nmol），y是ΔA。

2. 按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。

NADH-GDH(nmol/min /mg prot)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(V1×Cpr) ÷T =27.14×(ΔA+0.0064)÷Cpr

3. 按樣本鮮重計算：

單位定義：每克組織每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。

NADH-GDH(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(W×V1÷V) ÷T =27.14×(ΔA+0.0064)÷W

4. 按細菌/細胞密度計算：

單位定義：每1萬個細菌/細胞每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。

NADH-GDH(nmol/min /10⁴ cell)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(500×V1÷V) ÷T =0.0543×(ΔA+0.0064)

5. 按液體體積計算：

單位定義：每毫升液體每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。

NADH-GDH(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷V1÷T=27.14×(ΔA+0.0064)

V---加入提取液體積，1mL

V1---加入樣本體積，0.04mL

T---反應時間，15min

W---樣本質量，g

500---細菌或細胞總數，500萬

Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL

附：標準曲線制作過程：

1. 制備標準品母液（0.5nmol/μL）：向標準品離心管里面加入1.41ml蒸餾水（母液需在兩天內用且-20℃保存）。

2. 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0，0.04，0.08，0.12，0.16，0.2.nmol/μL。也可根據實際樣本來調整標準品濃度。

3. 依據測定管的加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

相關產品：