NADP蘋果酸酶(NADP-ME)活性檢測試劑盒 微板法

產品簡介：

蘋果酸酶是生物體內重要的酶之一，廣泛存在于動物、植物、細菌體中。是蘋果酸代謝的關鍵酶。近年來植物ME活性測定較多，已經成為抗氧化研究的熱點。該酶發揮作用需要 輔酶因子的參與,依據輔酶因子的不同,分為NADP-ME(EC1.1.1.40)和NAD-ME(EC1.1.1.38)。  

ME的主要功能是催化蘋果酸氧化脫羧產生丙酮酸和CO₂,以及伴隨NADP+的還原反 應,NADP-ME催化NADP+還原成 NADPH，本試劑盒通過檢測NADPH在340nm處的增加速率即可得出NADP-ME的酶活性大小。

保存條件: 

-20℃保存，三個月有效。

產品組成：

產品使用：

建議正式實驗前，選取2個樣本做預測定，了解實驗樣品情況，熟悉流程，避免樣本和試劑浪費！

一、樣本準備

1. 組織樣本：

(a) 稱取約0.1g組織，加入1mL提取液，進行冰浴勻漿；

(b) 12000rpm，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

【注】：若增加樣本量,可按組織質量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例提取

2. 細菌/細胞樣本：

(a) 先收集細胞或細菌到離心管內，離心后棄上清；

(b) 取5×10⁶個細胞或細菌加入1mL提取液，超聲波破碎細胞或細菌（冰浴，功率200w，超 聲3s，間隔10s，重復30次）；

(c) 12000rpm，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

【注】：若增加樣本量，可按每0.5~1×10⁷個細菌數量加入1mL提取液的比例進行提取。

3. 液體樣本：

直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。

二、樣品測定

1. 酶標儀預熱30min，設定波長到340nm。

2. 所有試劑在25℃水浴中孵育10min。

3. 在96孔板中依次加入：

【注】：若ΔA過小，可以延長反應時間T(如:10min 或更長)，或增加樣本上樣量 V1(如增至20uL，則試劑二相應減少)，重新調整的T或V1需代入計算公式重新計算。

三、結果計算

1. 按樣本蛋白濃度計算：

酶活定義：25℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活單位。

NADP-ME(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(V1×Cpr)÷T=2143.6×ΔA÷Cpr

2. 按樣本鮮重計算：

酶活定義：25℃條件下，每克組織蛋白每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活單位。

NADP-ME(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V1÷V)÷T=2143.6×ΔA÷W

3. 按細菌/細胞密度計算：

酶活定義：25℃條件下，每10⁴個細菌/細胞每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活單位。

NADP-ME(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V1÷V)÷T=4.29×ΔA

4. 按液體體積計算：

酶活定義：25℃條件下，每毫升液體每分鐘生成1nmolNADH定義為一個酶活力單位。

 NADP-ME(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷V1÷T=2143.6×ΔA

V--提取液體積，1mL

V1--加入樣本體積，0.01mL

V2--反應體系總體積，2×10^-4L

d--光徑，0.5cm

ε--NADH 摩爾消光系數，6.22×10³L/mol/cm

W--樣本質量，g

500--細胞數量，萬

T--反應時間，3min

Cpr--蛋白濃度（mg/mL）

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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