NADH-谷氨酸合成酶(NADH-GOGAT)活性檢測試劑盒

 非綠色組織 分光法

產(chǎn)品簡介：

谷氨酸合成酶（GOGAT）一般包含兩類：一類是多存在于葉綠體（葉片）中的Fd-GOGAT， 另一類是多存在于非綠色組織（根）前質(zhì)體中的NADH-GOGAT。GOGAT廣泛分布于植物中， 植物吸收的無機氮經(jīng)硝酸還原糖（NR）和亞硝酸還原酶（NIR）還原成NH4+后，通過谷氨酰 胺合成酶（GOGAT）參與的GS/GOGAT途徑才能進行氮素的同化和利用。

NADH-谷氨酸合成酶（NADH-GOGAT，EC1.4.1.14) 催化谷氨酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸，形成兩分子的谷氨酸；同時NADH氧化生成NAD+，可以通過檢測340nm吸光度的下降速率得出NADH-GOGAT的酶活性大小。

該酶催化的反應(yīng)：L-glutamine+2-oxoglutarate + NADH + H+=2 L-glutamate + NAD+。

保存條件: 

2-8℃保存，三個月有效。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

建議正式實驗前，選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解實驗樣品情況，熟悉流程，避免樣本和 試劑浪費！

一、樣本準(zhǔn)備：

1. 組織樣本：

(a) 稱取約0.1g組織（水分充足的樣本可以取0.5g），加入1mL提取液，進行冰浴勻漿；

(b) 12000rpm，4℃離心10min，取上清，置冰上測定。

【注】：1. 根據(jù)研究需求，可按組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例進行提取。

2. 若樣本顏色較深（如植物葉片），可引起起始值A1值較大如超過1.5，可在樣本制備過程中增加除色素步驟：取約0.2g組織（水分充足的樣本可取1g），加入80%乙醇冰浴勻漿，12000rpm，4℃ 離心10min，棄掉色素較深的上清液；以上除色素步驟重復(fù)2次。最后向離心得到的沉淀中加入1mL 提取液，混勻或再次冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：

(a) 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；

(b) 取5×10⁶個細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；

(c) 12000rpm，室溫離心15min，取上清測定。

【注】：若增加樣本量，可按每0.5~1×10⁷個細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量加入1mL提取液的比例進行提取。

二、樣品測定：

1. 紫外分光光度計預(yù)熱30min，設(shè)定波長到340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 在1mL石英比色皿（光徑1cm）中依次加入：

【注】：1.若A1太大如超過2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對會偏高），可以適當(dāng)減少樣本加樣量V1（如減至40μL，另外40μL用提取液補齊），則改變后的V1需代入計算公式重新計算。或者減少試劑一的加樣量（如減至80μL，另外80μL用蒸餾水補齊）或向待測樣本中 加少許活性炭混勻靜置5min后12000rpm,4℃離心10min，上清液用于檢測；

2. 若ΔA的值大于0.4，則需減少反應(yīng)時間（如減少至5min），則改變后的反應(yīng)時間T需代入計算公式重新計算。

3. 若下降趨勢不穩(wěn)定，可以每隔20S讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時間段來參與計算，相對應(yīng)的A值也代入計算公式重新計算。

三、結(jié)果計算

1．按蛋白濃度計算：

單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NADH-GOGAT(nmol Glu/min/mg prot）=2×[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(V1×Cpr) ÷T =3215.4 ×ΔA÷Cpr ÷T

2．按樣本質(zhì)量計算：

單位定義：每克組織每分鐘消耗1nmol 的NADH定義為一個酶活力單位。

NADH-GOGAT（nmolGlu/min/g 鮮重）=2×[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V1÷V) ÷T =3215.4×ΔA÷W÷T

V--提取液體積，1mL

V1--加入樣本體積，0.08mL

V2--反應(yīng)總體積，8×10^-4L

ε--NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm

d--1mL 石英比色皿光徑，1cm

T--反應(yīng)時間，本實驗中是10min

W--樣本質(zhì)量，g

Cpr---上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）

2--每合成2nmol 的Glu有1nmol的NADH被氧化

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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