輔酶Ⅱ NADP+/NADPH含量測定試劑盒 分光法

產品簡介：

煙酰胺核苷酸的測定一直是細胞或組織在能量轉化和氧化還原狀態方面的研究熱點。NADP+ 和NADPH 含量測定可以計算NADP（NADPH+NADP+)含量和NADPH/NADP+比值。NADP+ /NADPH 比值不僅是細胞氧化還原態的主要標志之一，而且其變化在磷酸戊糖途徑和生物合成以 及抗氧化反應中具有重要調控作用。

本試劑盒提供一種方便，快速的檢測方法，提供特異性提取液分別提取樣品中的NADP+和 NADPH，NADPH在遞氫體作用下與一種高靈敏度的顯色劑反應生成黃色水溶性甲瓚，在450nm 下檢測，得到NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶特異性還原NADP+為NADPH，從而檢測 NADP+含量。

保存條件: 

-20℃保存，三個月有效。

產品組成：

【注】：粉劑量在mg級別，使用前用手甩幾次或者進行離心，打開直接加入要求的試劑即可。

產品使用：

建議正式實驗前，選取 2 個樣本做預測定，了解實驗樣品情況，熟悉流程，避免樣本和試劑浪費！

一、樣本準備：

1. 組織樣本準備：

(a)  NADP+的提取：

取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液A，冰浴研磨，全部轉移到離心管中（用提取液A補齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動物樣本于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再 加V1體積的提取液B中和（可分次添加提取液B，調至PH約中性，記錄提取液B加入體積為 V1）；12000rpm，4℃離心5min，取上清液置于冰上待測。

(b) NADPH的提取：

取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部轉移到離心管中（用提取液B補齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動物樣本于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再 加V2體積的提取液A中和（可分次添加提取液A，調至PH約中性，記錄提取液A加入體積為V2）；12000rpm，4℃離心5min，取上清液置于冰上待測。

【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增加到0.2g等，可做幾個梯度選擇適合本次實驗的樣本量。

2. 細菌/細胞樣本準備：

(a) NADP+的提取：

先收集細胞或細菌到離心管內：取約5×10⁶個細菌或細胞加入1ml提取液A，冰浴研磨，全 部轉移到離心管中（用提取液A補齊到1mL），于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心 10min；取500μL 上清液至新離心管中，再加V1體積的提取液B中和（可分次添加提取液B，調至PH約中性，記錄提取液B加入體積為V1）；12000rpm，4℃離心5min，取上清液置于冰上待測。

(b) NADPH的提取：

先收集細胞或細菌到離心管內：取約5×10⁶個細菌或細胞加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部轉移到離心管中（用提取液B補齊1mL），于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V2體積的提取液A中和 （可分次添加提取液A，調至PH約中性，記錄提取液A加入體積為V2）；12000rpm4℃離心 5min，取上清置于冰上待測。

【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增至1×10⁷個等，可做幾個梯度選適合本次實驗的樣本量。

3. 液體樣本準備：

(a) NADP+的提取：

在離心管中加入約0.1mL液體樣本，然后再加入1mL提取液A（用提取液A補齊到1.1mL）， 于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V1體積的提取液B中和（可分次添加提取液B，調至PH約中性，記錄提取液B加入體積為V1）；12000rpm4℃離心5min，取上清置冰上待測。

(b) NADPH的提取：

在離心管中加入約0.1mL液體樣本，然后再加入1mL提取液B（用提取液B補齊到1.1mL）， 于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心10min；取500μL上清液至新離心管中，再加V2體積的提取液A中和（可分次添加提取液A，調至PH約中性，記錄提取液A加入體積為V2）；12000rpm 4℃離心5min，取上清液置于冰上待測。

【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增至0.5mL等，可做幾個梯度選擇適合本次實驗的樣本量。

二、樣品測定：

1. 可見分光光度計預熱 30min 以上，溫度設定37℃，調節波長至450nm，蒸餾水調零。 2. 在1mL玻璃比色皿（光徑1cm）中依次加入：

【注】若ΔA過小，可加大樣本取樣質量W；或增加樣本量V1（由70增至120μL，則試劑三相應減少），或延 長反應時間（如：60min或更長）；則改變后的相應變量需代入計算公式重新計算。

三、含量計算：

1. 標準曲線：y=2.671x-0.0111；x是NADPH摩爾質量（nmol），y 是ΔA。

2. NADP+含量的計算：

(1) 按樣本鮮重計算：

NADP+(nmol/g 鮮重）=[(△A+0.0111)÷2.671]÷(W÷2×V 樣÷V3)

=10.7×(△A+0.009)×(0.5+V1)÷W

(2) 按細菌或細胞密度計算：

NADP+(nmol/10⁴cell）=[(△A+0.0111)÷2.671]÷(500÷2×V 樣÷V3)

=0.021×(△A+0.009)×(0.5+V1)

(3) 液體中NADP+含量計算：

NADP+含量(nmol/mL）= [(△A+0.0111)÷2.671]÷(V 液÷2×V 樣÷V3)

=106.97×(△A+0.009)×(0.5+V1)

3. NADPH含量的計算：

(1) 按樣本鮮重計算：

NADPH(nmol/g 鮮重）=[(△A+0.0111)÷2.671]÷(W÷2×V 樣÷V4)

=10.7×(△A+0.009)×(0.5+V2)÷W

(2) 按細菌或細胞密度計算：

NADPH(nmol/10⁴ cell）=[(△A+0.0111)÷2.671]÷(500÷2×V 樣÷V4)

=0.021×(△A+0.009)×(0.5+V2)

(3) 液體中NADPH含量計算：

NADPH含量(nmol/mL）=[(△A+0.0111)÷2.671]÷(V 液÷2×V 樣÷V4)

=106.97×(△A+0.009) ×(0.5+V2)

V樣----加入反應體系中樣本體積，0.07mL

V液----所取液體樣本體積：0.1mL

V3---NADP+提取液體積，0.5mL提取液A+V1mL提取液B=（0.5+V1）mL

V4---NADPH 提取液體積，0.5mL提取液B+V2mL提取液A=（0.5+V2）mL

W----樣本質量，g

500----細胞或細菌總數，500萬

NADPH分子量----745.4

附：標準曲線制作過程：

1. 制備標準品母液（1μmol/mL）：向標準品離心管里面加入1.8mL蒸餾水（NADPH不太穩定，取出NADPH后請盡快使用。如果發現標準曲線不理想，很有可能是標準品發生了降解）。

2. 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0，1，2，3，4，5nmol/mL。也可根據實際樣本來調整 標準品濃度。

3. 依據測定管的加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。

注意事項：

1.      由于NADP+和NADPH很不穩定，較易降解，盡量使用新鮮樣品進行檢測。

2.      當僅檢測NADP+和NADPH的總量或者樣品中的NADPH的量時，一個本試劑盒可以進行48 次檢測；當檢測NADP+或者NADP+/NADPH的比值時，一個本試劑盒可以進行24次檢測。

3.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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