NADH氧化酶(NOX)活性檢測試劑盒 分光法

產品簡介：

NADH氧化酶（NOX，EC1.6.99.3）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生，而且與免疫反應密切相關。

NOX能夠將NADH氧化為NAD，通過檢測NADH于340nm處的下降速率，即可得出NADH氧化酶活性的大小。

保存條件: 

-20℃保存，3個月有效。

產品組成：

產品使用：

建議正式實驗前，選取2個樣本做預測定，了解實驗樣品情況，熟悉流程，避免樣本和試 劑浪費！

一、線粒體制備（提示：整個線粒體的提取過程須保持4℃低溫環境）

1. 稱取約0.2g組織或收集1000萬細菌/細胞，加入1mL試劑一，用冰浴勻漿器或研缽冰浴勻漿，轉移至離心管后于4℃×3000g離心20min；

2. 小心吸取上清液（棄沉淀）移至另一離心管中，4℃×16000g離心20min。用移液器移除上清液（上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的NOX（此步可選做））。 留下沉淀（沉淀即為線粒體）。

3. 在沉淀（線粒體）中加入200μL試劑二，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲5s，間隔3s，重復30次），液體置于冰上用于線粒體NOX酶活性測定。

【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例進行提取，或按照細菌/細胞數量（10⁴）：提取液（mL）為500~1000：1的比例進行提取。

二、樣品測定

1. 紫外分光光度計預熱30min以上，設定溫度25℃，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2. 所有試劑解凍至室溫（25℃）。

3. 在1mL石英比色皿（光徑1cm）中依次加入：

【注】若△A小于0.01，可以延長反應時間T（如至10min或更長），則改變后的反應時間T需代入公式重新計算。

三、含量計算

1. 按樣本蛋白濃度計算：

酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘氧化1nmolNADH定義為一個酶活單位。

NOX(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×10⁹]÷(V1×Cpr)÷T=396.6×ΔA÷Cpr

2. 按樣本鮮重計算：

酶活定義：每克組織每分鐘氧化1nmolNADH定義為一個酶活單位。

NOX(nmol/min/g鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×10⁹]÷(W×V1÷V)÷T=79.3×ΔA÷W

3. 按細菌或細胞密度計算：

酶活定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘氧化1nmolNADH定義為一個酶活力單位。

NOX(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×10⁹]÷(500×V1÷V)÷T=0.16×ΔA

ε---NADH 摩爾消光系數，6.22×10³L/mol/cm

d---1cm

V---加入試劑二的體積，0.2mL

V1---加入樣本體積，0.06mL

V2---反應體系總體積，7.4×10^-4L

T---反應時間，5min

W---樣本質量，g

500---細胞或細菌總數，萬

Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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