NAD+/NADH檢測試劑盒(WST-8法)

產(chǎn)品簡介：

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadenine dinucleotide, NAD)是所有細胞中都存在的一種輔酶，包括 NAD+(氧化型)和NADH(還原型)兩種形式。NAD+在細胞和體內(nèi)發(fā)揮著重要的功能，參與細胞凋亡、代謝調(diào)控和基因表達的調(diào)控等，并且NAD+的減少是細胞死亡的主要因素之一。傳統(tǒng)的NAD+/NADH以及NADP+/NADPH測定是通過檢測340nm處的吸收來 完成的，該方法靈敏度低且易受干擾。本產(chǎn)品基于 WST-8 的顯色反應(yīng)，通過比色法來檢測細胞、組織或其它樣品中NAD+(氧化型輔酶Ⅰ)和NADH(還原型輔酶Ⅰ)各自的量、比值和總量的檢測試劑盒。NAD/NADH檢測試劑盒能特異性地檢測NAD+和 NADH，而不檢測NADP+和NADPH，在反應(yīng)過程中NAD+被還原為NADH，NADH將WST-8還原成橙黃色formazan（甲臜），在 450nm左右有最大吸收峰。反應(yīng)體系中生成的formazan與樣品中NAD+或NADH的總量呈比例關(guān)系。

保存條件: 

-20℃保存，1年有效。

顯色液(NBS8094-2)和NADH(NBS8094-3)須-20℃避光保存。

NADH配制成溶液后，須適當(dāng)分裝后-80℃保存。所有試劑避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

1. 樣品的準備：

(a) 細胞樣品的準備：

對于貼壁細胞，約1×10⁶個細胞(大約相當(dāng)于6孔板一個孔長滿的細胞數(shù)量)，吸凈培養(yǎng)液，用移液器加入200μL預(yù)冷的NAD+/NADH提取液，并輕輕吹打，以促進細胞的裂解；對于懸浮細胞，約1×10⁶個細胞，600g離心5分鐘，吸凈培養(yǎng)液，用移液器加入200μL預(yù)冷的NAD+/NADH提取液，并輕輕吹打，以促進細胞的裂解；裂解過程在室溫或冰上操作均可。隨后12,000g，4℃離心5-10分鐘，取上清作為待測樣品備用。

(b) 組織樣品的準備：

冰上預(yù)冷的PBS洗滌組織后，稱取約10-30mg的組織樣品，用剪刀剪碎，置于勻漿器中，加入400μL的NAD+/NADH提取液在室溫或冰上進行勻漿。隨后12,000g， 4℃離心5-10分鐘，取上清作為待測樣品備用。

2. 試劑盒的準備工作：

(a) NADH標準品的配制：

吸取655μLNADH配制液，充分溶解本試劑盒提供的5mgNADH 后即得到10mM NADH標準品。10mM NADH標準品請適當(dāng)分裝后-80℃避光保存。

(b) NADH標準曲線的設(shè)置：

將10mM的NADH標準品用NAD+/NADH提取液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻龋绯醮螜z測可以設(shè)置0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10μM這幾個濃度，檢測時96孔板中每孔加入20μL的標準品，相當(dāng)于每孔為0、5、10、20、40、80、120、160、 200pmol的NADH。如有必要，在后續(xù)的實驗中可以根據(jù)樣品中的NADH含量對標準品的濃度范圍進行適當(dāng)調(diào)整。其中濃度為0μM的點為空白對照點，僅含NAD+/NADH提取液。

注意：由于NADH很不穩(wěn)定，故配制后需盡快使用。

(c) 乙醇脫氫酶工作液的配制：

將乙醇脫氫酶用反應(yīng)緩沖液稀釋45倍，例如2μL乙醇脫氫酶加入到88μL的反應(yīng)緩沖液中，即可獲得90μL的乙醇脫氫酶工作液。每個標準品或樣品的檢測需要使用90μL的乙醇脫氫酶工作液，請根據(jù)所需檢測的標準品和樣品的數(shù)量，配制適量的乙醇脫氫酶工作液，并注意現(xiàn)配現(xiàn)用。

3. 樣品測定：

(a) 樣品中NAD+和NADH的總量的測定：

吸取20μL待測樣品至96孔板中，為了減少實驗誤差建議設(shè)置樣品的重復(fù)孔。后續(xù)如果發(fā)現(xiàn)樣品中的NAD+和NADH的總量過高，超出標準曲線的范圍，則需要用NAD+/NADH提取液將樣品適當(dāng)稀釋后再進行檢測；總量過低時則需要加大細胞或組織樣品的用量。

(b) 樣品中NAD+、NADH 的含量或者NAD+/NADH比值的測定：

吸取50-100μL待測樣品于離心管中，60℃水浴或PCR儀上加熱30分鐘以分解NAD+。如果加熱后產(chǎn)生不溶物，則需10,000g，室溫或4℃離心5分鐘，吸取20μL上清液作為待測樣品至96孔板中，為了減少實驗誤差建議設(shè)置樣品的重復(fù)孔。后續(xù)如果發(fā)現(xiàn)樣品中的NAD+或NADH的含量過高，超出標準曲線的范圍，則需要用NAD+/NADH提取液將樣品適當(dāng)稀釋后再進行檢測；含量過低時則需要加大細胞或組織樣品的用量。

(c) 請參考下表使用96孔板設(shè)置空白對照孔、標準品孔和樣品孔。加入乙醇脫氫酶工作液后 充分混勻。

(d) 37℃避光孵育10分鐘。說明：此孵育步驟的目的是將樣品中的NAD+轉(zhuǎn)化為NADH；在加入乙醇脫氫酶工作液的過程中須輕柔操作，以免產(chǎn)生氣泡。若不慎出現(xiàn)氣泡，可使用細小的吸頭或針頭戳破。

(e) 適當(dāng)混勻顯色液，然后每孔加入10μL顯色液，混勻，37℃避光孵育30分鐘，此時會形成橙黃色的formazan。測量450nm處的吸光度。如果顯色較淺，也可以適當(dāng)延長孵育時間至45-60分鐘。

4. 結(jié)果結(jié)算：

(a) 計算標準品組中每個點的平均吸光度，減去空白對照組的吸光度，即為各個標準品的吸光度。

(b) 以 NADH的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制出標準曲線。NADH標準品的檢測效果請參考圖1。

圖1.NAD+和NADH的標準曲線。上圖顯示本試劑盒可以很好地檢測出NAD+和NADH的含量，并且不會受NADPH的干擾。不同的檢測條件下，實際讀數(shù)會因標準品的配制、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

(c) 根據(jù)標準曲線計算細胞、組織等樣品中的NAD+和NADH總濃度或者NADH的濃度。未60℃加熱處理時，檢測得到的是樣品中NAD+和NADH總量的濃度(NADtotal)；

60℃加熱處理后，檢測得到的是樣品中NADH的濃度。

備注：根據(jù)檢測得到的濃度及樣品的體積，即可計算出NAD+、NADH、NADtotal的量。

(d) 根據(jù)如下計算公式，計算樣品中NAD+的量以及NAD+/NADH的比值。此時可以把NAD+和NADH總量或各自的含量用單位細胞數(shù)量或單位組織重量中的含量來表示。 [NAD+] = [NAD total]- [NADH]

[NAD+]/[NADH] = ([NAD total]- [NADH])/[NADH]

(e) 如果希望更加精確地來表述NAD+和NADH總量或各自的含量，可以將樣品用BCA法測定蛋白濃度。最終用單位蛋白量中NAD+和NADH總量或各自的含量來比較精確地進行表述。

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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