NADP+/NADPH檢測試劑盒(WST-8法)

產品簡介：

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamideadeninedinucleotide phosphate, NADP)是很多氧化還原反應的輔酶，包括NADP+(氧化型)和NADPH(還原型)兩種形式。NADP+也參與到生物合成反應中，比如脂質和核酸的合成。傳統的NAD+/NADH和NADP+/

NADPH測定是通過檢測340nm處的吸收來完成的，該方法靈敏度低且易受干擾。而本試劑盒可以特異性地檢測NADP+和NADPH，而不檢測NAD+和NADH，在反應過程中NADP+被還原為NADPH，NADPH將WST-8還原成橙黃色formazan（甲臜），在450nm左右有最大吸收峰。反應體系中生成的formazan與樣品中NADP+或NADPH的總量呈比例關系。一次本產品基于WST-8的顯色反應，通過比色法來檢測細胞、組織或其它樣品中NADP+(氧化型輔酶Ⅱ)和NADPH(還原型輔酶Ⅱ)各自的量、比值和總量的檢測試劑盒。

保存條件: 

-20℃保存1年。

顯色液(NBS8095-2)和NADPH(NBS8095-3)須-20℃避光保存。

NADPH配制成溶液后，須適當分裝后-80℃保存。所有試劑避免反復凍融。

產品組成：

產品使用：

1. 樣品的準備：

(a) 細胞樣品的準備：

對于貼壁細胞，約1×10⁶個細胞(大約相當于6孔板一個孔長滿的細胞數量)，吸凈培養液，用移液器加入200μL預冷的NADP+/NADPH提取液，并輕輕吹打，以促進細胞的裂解；對于懸浮細胞，約1×10⁶個細胞，600g離心5分鐘，吸凈培養液，用移液器加入200μL預冷的NADP+/NADPH提取液，并輕輕吹打，以促進細胞的裂解；裂解過程在室溫或冰上操作均可。隨后12,000g，4℃離心5-10分鐘，取上清作為待測樣品備用。

(b) 組織樣品的準備：

冰上預冷的PBS洗滌組織后，稱取約10-30mg的組織樣品，用剪刀剪碎，置于勻漿器中，加入400μL的NADP+/NADPH提取液在室溫或冰上進行勻漿。隨后12,000g，4℃離心5-10分鐘，取上清作為待測樣品備用。

2. 試劑盒的準備工作：

(a) NADPH標準品的配制：

吸取6mL超純水充分溶解本試劑盒提供的5mg NADPH后即得到1mM NADPH標準品。1mM NADPH標準品請適當分裝后-80℃避光保存。

(b) NADPH標準曲線的設置：

把1mM的NADPH標準品用NADP+/NADPH提取液稀釋成適當的濃度梯度，如初次檢測可以設置0、0.25、0.5、1、2、4、6、8μM這幾個濃度，檢測時96孔板每孔加入50μL的標準品，相當于每孔為0、12.5、25、50、100、200、300、400pmol的NADPH。如有必要，在后續的實驗中可以根據樣品中的NADPH含量對標準品的濃度 范圍進行適當調整。其中濃度為0uM的點為空白對照點，僅含NADP+/NADPH提取液。

注意：由于NADPH很不穩定，故配制后需盡快使用。

(c) G6PDH工作液的配制：

將G6PDH用反應緩沖液稀釋50倍，例如2μL G6PDH加入到98μL的反應緩沖液中，即可獲得100μL的G6PDH工作液。每個標準品或樣品的檢測需要使用100μL的G6PDH工作液，請根據所需檢測的標準品和樣品的數量，配制適量的G6PDH工作液，并注意現配現用。

3. 樣品測定：

(a) 樣品中NADP+和NADPH總量的測定：

吸取50μL待測樣品至96孔板中，為了減少實驗 誤差請設置樣品的重復孔。后續如果發現樣品中的NADP+和NADPH的總量過高，超出標準曲線的范圍，則需要用NADP+/

NADPH提取液將樣品適當稀釋后再進行檢測；總量過低時則需要加大細胞或組織樣品的用量。

(b) 樣品中NADP+、NADPH的含量或者NADP+/NADPH比值的測定：

吸取100-200μL待測樣品于離心管中，60℃水浴或PCR儀上加熱30分鐘以分解NADP+。如果加熱后產生不溶物，則需10,000g，室溫或4℃離心5分鐘，吸取50μL上清液作為待測樣品至96孔板中，為了減少實驗誤差建議設置樣品的重復孔。后續如果發現樣品中的NADP+或NADPH的含量過高，超出標準曲線的范圍，則需要用NADP+/NADPH提取液將樣品適當稀釋后再進行檢測；含量過低時則需要加大細胞或組織樣品的用量。

(c) 請參考下表使用96孔板設置空白對照孔、標準品孔和樣品孔。加入G6PDH工作液后充分混勻。

(d) 37℃避光孵育10分鐘。說明：此孵育步驟的目的是將樣品中的NADP+轉化為NADPH； 在加入G6PDH工作液過程中須輕柔操作，以免產生氣泡。若不慎出現氣泡，可使用細小的吸頭或針頭戳破。

(e) 適當混勻顯色液，然后每孔加入10μL顯色液，混勻，37℃避光孵育10-20分鐘，此時會形成橙黃色的formazan。測量450nm處的吸光度。如果顯色較淺，也可以適當延長孵育時 間至30-60分鐘，隨著孵育時間延長，顯色會逐漸加深。

4. 結果結算：

(a) 計算標準品組中每個點的平均吸光度，減去空白對照組的吸光度，即為各個標準品的吸光 度。

(b) 以 NADPH的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制出標準曲線。NADPH標準品的檢測效果請參考圖1。如果孵育時間過長，高濃度標準品的顯色會達到平臺，此時宜選擇未達到平臺的標準品來繪制標準曲線，或者選擇孵育時間較短的標準品吸光度數據來繪制標準 曲線。

圖1.NADPH的標準曲線。上圖顯示本試劑盒可以很好地檢測出NADPH的含量，并且不會受 NADH的干擾。不同的檢測條件下，實際讀數會因標準品的配制、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數據僅供參考。

(c) 根據標準曲線計算細胞、組織等樣品中的NADP+和NADPH總濃度或者NADPH的濃度。

未60℃加熱處理時，計算得到的是樣品中NADP+和NADPH總量的濃度(NADPtotal)；60℃加熱處理后，檢測得到的是樣品中NADPH的濃度。

備注：根據檢測得到的濃度及樣品的體積，即可計算出NADP+、NADPH、NADPtotal的量。

(d) 根據檢測得到的濃度及樣品的體積，即可計算出NADP+、NADPH、NADPtotal的量。 (e) [NADP+] = [NADPtotal]- [NADPH]

[NADP+]/[NADPH] = ([NADPtotal]- [NADPH])/[NADPH]

(f) 如果希望更加精確地來表述NADP+和NADPH總量或各自的含量，可以將樣品用BCA法測定蛋白濃度。最終用單位蛋白量中NADP+和NADPH總量或各自的含量來比較精確地進行表述。

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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